Examenvragen + oplossing GIP
Bespreek de belangrijkste kenmerken van het pUC19 plasmide (tekening plasmide gegeven) + hoe
weten we dat de transformatie van competente E.coli cellen met dit plasmide gelukt is? + wat verstaan
we onder blauw/wit selectie bij klonering in het plasmide? (5 punten)
(handleiding p30)
pUC19:
Belangrijkste elementen:
1. ORI: startsite replicate plasmide
2. AmpR: beta-lactamase breekt beta-lactamring van Amp (agar) af -> geen functioneel Amp
3. LacZalfa: N-terminus van LacZ gen = reportergen
Tranformatie LacZalfa gen in bacterie met lacZbeta deel -> volledig LacZ gen -> functioneel
beta-galactosidase. IPTG induceert de lac promotor voor aanmaak beta-galactosidase, leaky
expression kan plaatsvinden.
X-gal wordt afgebroken door beta-gelactosidase -> blauw precipitaat
Transformatie gelukt? Bacterie groeit op agar met Amp, witte kolonies op agar zonder X-gal, blauwe
kolonies op agar met X-gal
Blauw/wit selectie: MCS met aantal restrictie sites aan het begin van LacZ gen. Insertie van een ander
gen in LacZ mbv. restrictie digestie -> niet-functioneel beta-galactosidase -> X-gal wordt niet
afgebroken -> witte kolonies waar transformatie heeft plaatsgevonden (enkel bij pUC19)
,bespreek de belangrijkste kenmerken van het pGLO plasmide (tekening van plasmide wordt gegeven
+ ook afbeelding van de werking van het ara operon) + Hoe weten we dat de transformatie van
competente E. coli cellen met dit plasmide gelukt is? + bespreek de rol van het ara operon in de
expressie van GFPuv
(handleiding p31)
pGLO:
Belangrijkste elementen:
1. ORI: = origin of replication
2. AmpR-gen: codeert voor B-lactamase. Dit breekt de B-lactamring van ampicilline af, waardoor
ampicilline zijn werking verliest.
3. GFPuv-gen: fluorescerend groen onder UV-licht = reportergen, wordt afgeschreven na PBAD
promotor
4. PBAD: induceerbare promotor voor het GPVuv gen
5. araC: codeert voor AraC proteïne = repressor PBAD, RNAP zal niet kunnen binden op PBAD
Arabinose bindt AraC -> conformatieverandering AraC -> bindingsplaats voor RNAP op DNA
komt vrij -> GFPuv wordt afgeschreven
Transformatie gelukt? Bacterie groeit op agar met Amp, witte kolonies op agar zonder arabinose,
groene kolonies onder UV-licht op agar met arabinose.
, oefening zuiverheid DNA: absorbantie bij 260 en 280 nm gegeven en DNA/RNA bepalen en
concentratie nucleïnezuren (er zijn geen proteïnen in het mengsel aanwezig)
(handleiding p40-41)
a260/a280
~1,8 -> zuiver DNA
~2 -> zuiver RNA
Als verhouding lager is -> aanwezigheid van contaminanten die sterk absorberen bij 280 nm
Als er geen proteine zijn kunt ge dees ni gebruiken
%P + %N = 100
Voor 1 mg/ml DNA: a260,n=20 en a280,n=10
Voor 1 mg/ml eiwitten: a260,p=0,57 en a280,p=1
-> 2 vergelijkingen en 2 onbekenden
(%= 1g/100ml)
Bespreek de belangrijkste kenmerken van het pUC19 plasmide (tekening plasmide gegeven) + hoe
weten we dat de transformatie van competente E.coli cellen met dit plasmide gelukt is? + wat verstaan
we onder blauw/wit selectie bij klonering in het plasmide? (5 punten)
(handleiding p30)
pUC19:
Belangrijkste elementen:
1. ORI: startsite replicate plasmide
2. AmpR: beta-lactamase breekt beta-lactamring van Amp (agar) af -> geen functioneel Amp
3. LacZalfa: N-terminus van LacZ gen = reportergen
Tranformatie LacZalfa gen in bacterie met lacZbeta deel -> volledig LacZ gen -> functioneel
beta-galactosidase. IPTG induceert de lac promotor voor aanmaak beta-galactosidase, leaky
expression kan plaatsvinden.
X-gal wordt afgebroken door beta-gelactosidase -> blauw precipitaat
Transformatie gelukt? Bacterie groeit op agar met Amp, witte kolonies op agar zonder X-gal, blauwe
kolonies op agar met X-gal
Blauw/wit selectie: MCS met aantal restrictie sites aan het begin van LacZ gen. Insertie van een ander
gen in LacZ mbv. restrictie digestie -> niet-functioneel beta-galactosidase -> X-gal wordt niet
afgebroken -> witte kolonies waar transformatie heeft plaatsgevonden (enkel bij pUC19)
,bespreek de belangrijkste kenmerken van het pGLO plasmide (tekening van plasmide wordt gegeven
+ ook afbeelding van de werking van het ara operon) + Hoe weten we dat de transformatie van
competente E. coli cellen met dit plasmide gelukt is? + bespreek de rol van het ara operon in de
expressie van GFPuv
(handleiding p31)
pGLO:
Belangrijkste elementen:
1. ORI: = origin of replication
2. AmpR-gen: codeert voor B-lactamase. Dit breekt de B-lactamring van ampicilline af, waardoor
ampicilline zijn werking verliest.
3. GFPuv-gen: fluorescerend groen onder UV-licht = reportergen, wordt afgeschreven na PBAD
promotor
4. PBAD: induceerbare promotor voor het GPVuv gen
5. araC: codeert voor AraC proteïne = repressor PBAD, RNAP zal niet kunnen binden op PBAD
Arabinose bindt AraC -> conformatieverandering AraC -> bindingsplaats voor RNAP op DNA
komt vrij -> GFPuv wordt afgeschreven
Transformatie gelukt? Bacterie groeit op agar met Amp, witte kolonies op agar zonder arabinose,
groene kolonies onder UV-licht op agar met arabinose.
, oefening zuiverheid DNA: absorbantie bij 260 en 280 nm gegeven en DNA/RNA bepalen en
concentratie nucleïnezuren (er zijn geen proteïnen in het mengsel aanwezig)
(handleiding p40-41)
a260/a280
~1,8 -> zuiver DNA
~2 -> zuiver RNA
Als verhouding lager is -> aanwezigheid van contaminanten die sterk absorberen bij 280 nm
Als er geen proteine zijn kunt ge dees ni gebruiken
%P + %N = 100
Voor 1 mg/ml DNA: a260,n=20 en a280,n=10
Voor 1 mg/ml eiwitten: a260,p=0,57 en a280,p=1
-> 2 vergelijkingen en 2 onbekenden
(%= 1g/100ml)
