Biotechnologie technieken
Algemene Specifieke Stappen/werking
Techniek
toepassing toepassing
Het te kloneren DNA-fragment wordt in het LacZ-gen
geplaatst, dit maakt het LacZ-gen inactief.
X-gal en IPTG worden toegevoegd aan het
voedingsmedium. IPTG activeert de Lac-promotor.
Identificeren van
Als de klonering niet succesvol is geweest is het
bacteriën met
Blauw wit screening Identificeren LacZ-gen nog steeds actief waardoor X-gal de
recombinant DNA in
geproduceerde β-galactosidase gaat afbreken en de
het LacZ gen
bacteriën blauw worden. Bij bacteriën waarin
klonering succesvol is geweest, blijft het LacZ-gen
inactief, waardoor er geen β-galactosidase wordt
geproduceerd en de bacteriekolonies wit blijven.
1. Denaturatie (94-96 °C): DNA denatureert
2. Hybridisatie/annealing (45-60 °C): primers binden
3. Extension/elongation (70-75 °C): taq polymerase
verlengt de ketens vanaf de primers
Vermenigvuldigen van
PCR Vermenigvuldigen Benodigdheden: template DNA, twee primers (een
DNA
voor en een na het gen), nucleotiden en (taq) DNA
polymerase.
Voordelen PCR: snel en gevoelig
Nadeel: je moet de sequentie weten voor de probe
1. Groei van bacteriën van cDNA-bank op een
voedingsbodem tot kolonies.
2. Overdracht van kolonies naar een membraan.
3. Behandeling van cellen op het membraan om ze te
Identificeren van
laten lyseren, DNA te denatureren en te fixeren.
Colony blotting Identificeren kolonies met gewenst
4. Toevoeging van een probe die kan binden aan het
DNA fragment
gen van interesse.
5. Afspoelen van het membraan.
6. Probe zichtbaar maken.
7. Kolonies uit originele plaat selecteren en opgroeien
1. Bereid een agarosegel voor met uitsparingen (wells).
2. Breng DNA-monsters aan in de wells en plaats de gel
in een buffer met elektrodes.
Scheiden van
Agarose 3. Laat de DNA-fragmenten migreren door de gel onder
Scheiden DNA/RNA fragmenten
gelelektroforese elektrische spanning; kleine fragmenten bewegen
op grootte
sneller dan grote.
4. Markeer het DNA met een fluorescerend label.
5. Visualiseer het gelabelde DNA onder UV-licht.
1. DNA scheiden met agarose gelelektroforese
2. DNA overbrengen op een membraan van
Identificeren van een
nitrocellulose
Southern blot Identificeren DNA fragment na gel
3. Membraan hybridiseren met een probe
elektroforese
4. Probe zichtbaar maken
FISH Identificeren Identificeren van een 1. Chromosomen isoleren
DNA fragment op een 2. Chromosomen overbrengen op een glasplaat
bepaald chromosoom 3. Glasplaat hybridiseren met een gelabelde probe
4. Glasplaat wassen
5. Probe detecteren door te kijken onder een
, fluorescentie microscoop
Sanger sequencing: sequencing met behulp van
dideoxynucleotiden. Tijdens DNA-replicatie als een
dideoxynucleotide wordt ingebouwd stopt de keten
met verlegen, zo krijg je ketens van verschillende
lengtes. Deze ketens scheid je op basis van grootte
met behulp van elektroforese waardoor je de
sequentie kan aflezen.
Next generation sequencing: er worden hierbij
meerdere sequenties tegelijkertijd gesequenced en
er zijn verschillende soorten aan methodes
ontwikkeld. Voorbeeld methode: het genomisch
DNA wordt geknipt, elke fragment wordt door PCR
vermenigvuldigd, deze kopieën worden gekoppeld
DNA sequentie aan een bolletje. De bolletjes worden in een welletje
Sequencing Sequencen
bepalen gebracht en er wordt DNA polymerase, primers en
deoxynucleotiden toegevoegd. Nu worden alle
nucleotiden één voor één toegevoegd, als een
nucleotide bind wordt dat gedetecteerd met een
lichtflits. Zo kan de sequentie van de fragmenten
worden bepaald.
Third generation sequencing: is gebaseerd op het
sequencen van slechts één enkel molecuul
enkelstrengs DNA. DNA polymerase is vastgemaakt
in een porie van 10 nm, DNA en gelabelde
deoxynucelotiden (een andere label per soort
deoxynucleotide) worden toegevoegd. Wanneer een
nucleotide wordt ingebouwd komt de gelabelde
groep vrij en wordt deze gedetecteerd.
Identificeren van een
RNA fragment na Precies hetzelfde als een southern blot maar dan
Northern blot Identificeren gelelektroforese / voor het detecteren van RNA.
genexpressie bepalen
van één specifiek gen
1. Omzetten van mRNA naar cDNA door reverse
transcriptase
2. PCR reactie uitvoeren op het cDNA
3. De hoeveelheid PCR meten (dit is gerelateerd aan de
hoeveelheid mRNA er aanwezig was) waardoor je
weet hoeveel genexpressie er aanwezig is
Het meten van PCR kan met:
o SYBR green: SYBR green (kleurstof) bind aan
dubbelstrengs DNA, hoe meer PCR product
Genexpressie Genexpressie bepalen hoe meer fluorescentie.
RT-PCR
bepalen van één specifiek gen o Taqman probe: taqman probe bind aan het
DNA tussen de twee primers in, als taq
polymerase de probe tegen komt op het
DNA zal het met zijn 5’ uiteinde (die een
exonuclease activiteit heeft) de
fluorescerende groep R en de quencher
groep Q van de taqman probe scheiden van
elkaar. Deze scheiding zorgt voor
fluorescentie. Hoe meer PCR hoe meer
fluorescentie.
cDNA microarray Genexpressie Genexpressie bepalen 1. Bereid een microarraychip met enkelstrengs DNA-
bepalen van meerdere genen fragmenten van interesse.
Algemene Specifieke Stappen/werking
Techniek
toepassing toepassing
Het te kloneren DNA-fragment wordt in het LacZ-gen
geplaatst, dit maakt het LacZ-gen inactief.
X-gal en IPTG worden toegevoegd aan het
voedingsmedium. IPTG activeert de Lac-promotor.
Identificeren van
Als de klonering niet succesvol is geweest is het
bacteriën met
Blauw wit screening Identificeren LacZ-gen nog steeds actief waardoor X-gal de
recombinant DNA in
geproduceerde β-galactosidase gaat afbreken en de
het LacZ gen
bacteriën blauw worden. Bij bacteriën waarin
klonering succesvol is geweest, blijft het LacZ-gen
inactief, waardoor er geen β-galactosidase wordt
geproduceerd en de bacteriekolonies wit blijven.
1. Denaturatie (94-96 °C): DNA denatureert
2. Hybridisatie/annealing (45-60 °C): primers binden
3. Extension/elongation (70-75 °C): taq polymerase
verlengt de ketens vanaf de primers
Vermenigvuldigen van
PCR Vermenigvuldigen Benodigdheden: template DNA, twee primers (een
DNA
voor en een na het gen), nucleotiden en (taq) DNA
polymerase.
Voordelen PCR: snel en gevoelig
Nadeel: je moet de sequentie weten voor de probe
1. Groei van bacteriën van cDNA-bank op een
voedingsbodem tot kolonies.
2. Overdracht van kolonies naar een membraan.
3. Behandeling van cellen op het membraan om ze te
Identificeren van
laten lyseren, DNA te denatureren en te fixeren.
Colony blotting Identificeren kolonies met gewenst
4. Toevoeging van een probe die kan binden aan het
DNA fragment
gen van interesse.
5. Afspoelen van het membraan.
6. Probe zichtbaar maken.
7. Kolonies uit originele plaat selecteren en opgroeien
1. Bereid een agarosegel voor met uitsparingen (wells).
2. Breng DNA-monsters aan in de wells en plaats de gel
in een buffer met elektrodes.
Scheiden van
Agarose 3. Laat de DNA-fragmenten migreren door de gel onder
Scheiden DNA/RNA fragmenten
gelelektroforese elektrische spanning; kleine fragmenten bewegen
op grootte
sneller dan grote.
4. Markeer het DNA met een fluorescerend label.
5. Visualiseer het gelabelde DNA onder UV-licht.
1. DNA scheiden met agarose gelelektroforese
2. DNA overbrengen op een membraan van
Identificeren van een
nitrocellulose
Southern blot Identificeren DNA fragment na gel
3. Membraan hybridiseren met een probe
elektroforese
4. Probe zichtbaar maken
FISH Identificeren Identificeren van een 1. Chromosomen isoleren
DNA fragment op een 2. Chromosomen overbrengen op een glasplaat
bepaald chromosoom 3. Glasplaat hybridiseren met een gelabelde probe
4. Glasplaat wassen
5. Probe detecteren door te kijken onder een
, fluorescentie microscoop
Sanger sequencing: sequencing met behulp van
dideoxynucleotiden. Tijdens DNA-replicatie als een
dideoxynucleotide wordt ingebouwd stopt de keten
met verlegen, zo krijg je ketens van verschillende
lengtes. Deze ketens scheid je op basis van grootte
met behulp van elektroforese waardoor je de
sequentie kan aflezen.
Next generation sequencing: er worden hierbij
meerdere sequenties tegelijkertijd gesequenced en
er zijn verschillende soorten aan methodes
ontwikkeld. Voorbeeld methode: het genomisch
DNA wordt geknipt, elke fragment wordt door PCR
vermenigvuldigd, deze kopieën worden gekoppeld
DNA sequentie aan een bolletje. De bolletjes worden in een welletje
Sequencing Sequencen
bepalen gebracht en er wordt DNA polymerase, primers en
deoxynucleotiden toegevoegd. Nu worden alle
nucleotiden één voor één toegevoegd, als een
nucleotide bind wordt dat gedetecteerd met een
lichtflits. Zo kan de sequentie van de fragmenten
worden bepaald.
Third generation sequencing: is gebaseerd op het
sequencen van slechts één enkel molecuul
enkelstrengs DNA. DNA polymerase is vastgemaakt
in een porie van 10 nm, DNA en gelabelde
deoxynucelotiden (een andere label per soort
deoxynucleotide) worden toegevoegd. Wanneer een
nucleotide wordt ingebouwd komt de gelabelde
groep vrij en wordt deze gedetecteerd.
Identificeren van een
RNA fragment na Precies hetzelfde als een southern blot maar dan
Northern blot Identificeren gelelektroforese / voor het detecteren van RNA.
genexpressie bepalen
van één specifiek gen
1. Omzetten van mRNA naar cDNA door reverse
transcriptase
2. PCR reactie uitvoeren op het cDNA
3. De hoeveelheid PCR meten (dit is gerelateerd aan de
hoeveelheid mRNA er aanwezig was) waardoor je
weet hoeveel genexpressie er aanwezig is
Het meten van PCR kan met:
o SYBR green: SYBR green (kleurstof) bind aan
dubbelstrengs DNA, hoe meer PCR product
Genexpressie Genexpressie bepalen hoe meer fluorescentie.
RT-PCR
bepalen van één specifiek gen o Taqman probe: taqman probe bind aan het
DNA tussen de twee primers in, als taq
polymerase de probe tegen komt op het
DNA zal het met zijn 5’ uiteinde (die een
exonuclease activiteit heeft) de
fluorescerende groep R en de quencher
groep Q van de taqman probe scheiden van
elkaar. Deze scheiding zorgt voor
fluorescentie. Hoe meer PCR hoe meer
fluorescentie.
cDNA microarray Genexpressie Genexpressie bepalen 1. Bereid een microarraychip met enkelstrengs DNA-
bepalen van meerdere genen fragmenten van interesse.
