DEEL 2 : DETECTIE EN ZUIVERING VAN
BIOTECHNOLOGISCH AANGEMAAKTE EIWITTEN
1. Detectie van recombinante eiwitten
1.1. Detectie van eiwitten in oplossing
Verscheidene colorimetrische en fluorimetrische methoden beschikbaar
(bv methoden van Lowry, Bradford, BCA (Pierce) en NanoOrange (Molecular Probes))
Principe:
- Eiwitten binden op een min of meer aspecifieke manier aan een kleurstof of een
fluorescerende stof
- Bij binding veranderen de spectroscopische eigenschappen van deze stoffen
- Concentratie wordt bepaald aan de hand van een ijkingscurve (meestal goedkoop
eiwit zoals BSA [bovine serum albumine]).
Coomassie (Bradford) eiwitassay (heel veel toegepast)
Beschreven door Marion Bradford in 1976
Eiwitten (>3 kDa) binden op Coommassie G-250 in een
zure omgeving
→ spectrale shift van rood/bruin naar blauw
Aminozuren of peptiden (moeten zekere grootte hebben)
binden niet op Coomassie G-250
Voordelen
- Snel en eenvoudig
- Meting bij kamertemperatuur
- Compatibel met meeste zouten, solventen en buffers
Nadelen :
- De assay produceert een niet-lineaire standaardcurve
- Binding van Coomassie G-250 met eiwit afhankelijk van
bepaalde basische aminozuren (vooral arginine) en
hydrofobe aminozuren
→ Aminozuursamenstelling van eiwit bepaalt concentratie-
absorptie curve
→ Geschikte standaard gebruiken (ong zelfde AZ als je eiwit)
- Niet compatibel met detergenten (precipitatie van Coomassie G-250)
- Sommige eiwitten weinig oplosbaar in zure Coomassie G250 reagens
- Methode niet erg gevoelig (Range: 100-1500 µg/ml)
Bicinchoninic acid (BCA) eiwitassay (2e klassieker die men vaak toepast)
Beschreven door Paul K Smith in 1985
Principe:
- Reductie van Cu2+ naar Cu1+ door eiwit in een alkalisch milieu
- Interactie van Cu1+ met 2 BCA moleculen tot een purper-gekleurd BCA-Cu 1+ complex
- Meting bij bepaalde golflengte
, Voordelen BCA assay
- Compatibel met meeste detergenten (tot 5%)
- Beter lineair bereik ivm Bradford
- Eiwit-tot-eiwit variatie vs kleurvorming relatief laag
- Hogere gevoeligheid ivm Bradford Range: 20-2000 µg/ml
Nadelen BCA assay
- Substanties die koper reduceren: produceren kleur in BCA assay
- Reagentia die koper cheleren (wegvangen) : inhiberen kleurreactie
- Sommige vrije aminozuren produceren kleur in BCA assay
- Reactie niet bij kamertemperatuur (37°C, 30 min).
Incubaties bij temperaturen >37°C (bv. 60°C, 30 min) geven hogere gevoeligheid (5-
250 µg/ml)
In sommige eiwitbepalingen : modificatie van een specifieke functionele groep van de eiwitten
(meestal primaire aminogroepen van de lysine zijketens en de N-terminus)
Voorbeeld : fluorescamine methode
Het adduct is fluorescerend, het reagens niet
De overmaat aan reagens hydrolyseert snel in water tot niet fluorescerende
eindproducten
Enkel toepasbaar in buffers die geen primaire amines bevatten
Methode ook gebruikt om het aantal aminogroepen te bepalen in oplossing
1.2. SDS polyacrylamide gelelektroforese
Doel : eiwitten scheiden volgens hun grootte door een elektrische spanning aan te leggen
tussen de uiteinden van de gel
2 mogelijkheden
- Scheiding onder natieve condities: netto lading en de massa van het natieve eiwit
bepaalt op welke plaats het zal migreren
- Scheiding onder denaturerende condities: SDS polyacrylamide gelelectroforese
Toepassingen
- Beoordeling van de zuiverheid van een eiwitpreparaat
- Bepaling van het molecuulgewicht van een eiwit
- Nagaan van eiwitdegradatie
SDS polyacrylamide gelelektroforse : eiwitten worden opgenomen in een buffer met
volgende componenten :
Een reducerend agens (β-mercaptoethanol of dithiothreitol)
- Reduceert S-S verbindingen
Een denaturerend agens (SDS = sodium dodecyl sulphate)
- SDS = anionisch detergent
- Bindt met eiwitten in een stoechiometrische verhouding van 1,4 g SDS/g eiwit
→ Eiwitten worden negatief geladen staafjes
- Negatieve lading afkomstig van sulfaatgroep van SDS
- In een SDS-gel zullen alle eiwitten dus naar de positieve elektrode migreren
BIOTECHNOLOGISCH AANGEMAAKTE EIWITTEN
1. Detectie van recombinante eiwitten
1.1. Detectie van eiwitten in oplossing
Verscheidene colorimetrische en fluorimetrische methoden beschikbaar
(bv methoden van Lowry, Bradford, BCA (Pierce) en NanoOrange (Molecular Probes))
Principe:
- Eiwitten binden op een min of meer aspecifieke manier aan een kleurstof of een
fluorescerende stof
- Bij binding veranderen de spectroscopische eigenschappen van deze stoffen
- Concentratie wordt bepaald aan de hand van een ijkingscurve (meestal goedkoop
eiwit zoals BSA [bovine serum albumine]).
Coomassie (Bradford) eiwitassay (heel veel toegepast)
Beschreven door Marion Bradford in 1976
Eiwitten (>3 kDa) binden op Coommassie G-250 in een
zure omgeving
→ spectrale shift van rood/bruin naar blauw
Aminozuren of peptiden (moeten zekere grootte hebben)
binden niet op Coomassie G-250
Voordelen
- Snel en eenvoudig
- Meting bij kamertemperatuur
- Compatibel met meeste zouten, solventen en buffers
Nadelen :
- De assay produceert een niet-lineaire standaardcurve
- Binding van Coomassie G-250 met eiwit afhankelijk van
bepaalde basische aminozuren (vooral arginine) en
hydrofobe aminozuren
→ Aminozuursamenstelling van eiwit bepaalt concentratie-
absorptie curve
→ Geschikte standaard gebruiken (ong zelfde AZ als je eiwit)
- Niet compatibel met detergenten (precipitatie van Coomassie G-250)
- Sommige eiwitten weinig oplosbaar in zure Coomassie G250 reagens
- Methode niet erg gevoelig (Range: 100-1500 µg/ml)
Bicinchoninic acid (BCA) eiwitassay (2e klassieker die men vaak toepast)
Beschreven door Paul K Smith in 1985
Principe:
- Reductie van Cu2+ naar Cu1+ door eiwit in een alkalisch milieu
- Interactie van Cu1+ met 2 BCA moleculen tot een purper-gekleurd BCA-Cu 1+ complex
- Meting bij bepaalde golflengte
, Voordelen BCA assay
- Compatibel met meeste detergenten (tot 5%)
- Beter lineair bereik ivm Bradford
- Eiwit-tot-eiwit variatie vs kleurvorming relatief laag
- Hogere gevoeligheid ivm Bradford Range: 20-2000 µg/ml
Nadelen BCA assay
- Substanties die koper reduceren: produceren kleur in BCA assay
- Reagentia die koper cheleren (wegvangen) : inhiberen kleurreactie
- Sommige vrije aminozuren produceren kleur in BCA assay
- Reactie niet bij kamertemperatuur (37°C, 30 min).
Incubaties bij temperaturen >37°C (bv. 60°C, 30 min) geven hogere gevoeligheid (5-
250 µg/ml)
In sommige eiwitbepalingen : modificatie van een specifieke functionele groep van de eiwitten
(meestal primaire aminogroepen van de lysine zijketens en de N-terminus)
Voorbeeld : fluorescamine methode
Het adduct is fluorescerend, het reagens niet
De overmaat aan reagens hydrolyseert snel in water tot niet fluorescerende
eindproducten
Enkel toepasbaar in buffers die geen primaire amines bevatten
Methode ook gebruikt om het aantal aminogroepen te bepalen in oplossing
1.2. SDS polyacrylamide gelelektroforese
Doel : eiwitten scheiden volgens hun grootte door een elektrische spanning aan te leggen
tussen de uiteinden van de gel
2 mogelijkheden
- Scheiding onder natieve condities: netto lading en de massa van het natieve eiwit
bepaalt op welke plaats het zal migreren
- Scheiding onder denaturerende condities: SDS polyacrylamide gelelectroforese
Toepassingen
- Beoordeling van de zuiverheid van een eiwitpreparaat
- Bepaling van het molecuulgewicht van een eiwit
- Nagaan van eiwitdegradatie
SDS polyacrylamide gelelektroforse : eiwitten worden opgenomen in een buffer met
volgende componenten :
Een reducerend agens (β-mercaptoethanol of dithiothreitol)
- Reduceert S-S verbindingen
Een denaturerend agens (SDS = sodium dodecyl sulphate)
- SDS = anionisch detergent
- Bindt met eiwitten in een stoechiometrische verhouding van 1,4 g SDS/g eiwit
→ Eiwitten worden negatief geladen staafjes
- Negatieve lading afkomstig van sulfaatgroep van SDS
- In een SDS-gel zullen alle eiwitten dus naar de positieve elektrode migreren
