Practicum Biochemie en Biotechnologie
Practicum biotechnologie en biochemie
1 PROTEINEBEPALING MET LOWRYMETHODE
A THEORIE
THEORIE
STRUCTUUR PROTEÏNEN / EIWITTEN: meest voorkomende organische moleculen in het menselijk lichaam
• Opgebouwd uit steeds weerkerende “motieven” van aminozuren (AZ)
- Structuur AZ:
° centraal C-stofatoom
° H-atoom
° aminogroep (-NH2)
° carbonzuurgroep (-COOH)
° variabele R-groep (of Rest-groep)
- AZ verbonden via peptidebindingen
-> N-terminus met C-terminus
• 4 verschillende niveaus in de structuur van eiwitten
1. Primaire structuur
= aminozuurvolgorde van het eiwit
2. Secundaire structuur
= plaatselijke ruimtelijke structuur die een bepaalde volgorde van aminozuren in een polypeptideketen
aanneemt (= α-helix en β-plaat)
3. Tertiaire structuur
= uiteindelijke driedimensionale vouwing van 1 polypeptideketen die ontstaat als verschillende delen van het
eiwit, elk met hun eigen secundaire structuur, bij elkaar komen
-> Hier vinden interacties plaats tussen zijketens AZ (H-bruggen, ionbindingen,..)
4. Quaternaire structuur
= manier waarop verschillende gevouwen polypeptideketens bij elkaar komen in de uiteindelijke eiwitstructuur
FUNCTIES VAN EIWITTEN
• Vorm en structuur van cellen en weefsels (bv. keratine,collageen)
• Beweging (bv. actine- en myosinefilamenten)
• Transport (bv. albumine, hemoglobine)
• Enzymen (bv. amylase, pepsidase)
• Hormonen (bv. insuline)
• Verdediging (bv. antilichamen)
=> Verlies van eiwitten kan leiden tot onherstelbareschade aan organen en orgaanstelsels
DENATURATIE
• Wat?
- verlies van de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur
- primaire structuur blijft behouden
• Oorzaak? Tabel
• Gevolg? Functieverlies eiwit
,B PRAKTIJK
A VERDUNNINGSREEKS PROTEÏNE MAKEN: LOWRY-METHODE
Lowrymethode
= gevoelige colorimetrische assay => 2 kleurvormende reacties => verhoging van de gevoeligheid
1 Breng in verschillende proefbuizen de volumes (in ml) zoals weergegeven in onderstaande tabel:
• Oplossing A: NaOH (0,5 M),
CuSO4 (0,05%), Na2CO3 (10%),
NaK-C4H4O64H2O (Natrium
kaliumtartraat) (0,1%)
Opgelet! Cu++ is giftig!
• Oplossing B: waterigeoplossing van het
serumalbumine (200mg/l)
• Oplossing C: onbekende oplossing van
serumalbumine
2 Meng telkens, laat de oplossing 10 minuten bij kamertemperatuur staan.
=> Kleurreactie 1: Proteïne (oplossing B of C) + Cu2+ (oplossing A) => complexatie Cu2+ met peptidebindingen
-> in aanwezigheid van een base (NaOH) en natrium kaliumtartraat, met de peptidebindingen
-> diep blauwe kleur
3 Voeg aan elke proefbuis 4 ml Folin-Ciocalteureagens toe (oplossing D)
=> Kleurreactie 2: Proteïne + Folin- ciocalteureagens (oplossing D) => reductie fosfomolybdaat
-> reductie door reactie met tyrosine en tryptofaan in de proteïneketen
-> diep blauwe kleur
4 Meng goed door omzwenken (gebruik parafilm)
5 Laat de oplossing minimum 30 minuten bij kamertemperatuur staan.
B SPECTROFOTOMETRIE: LAMBERT-BEER
Lambert-Beer
= wanneer een lichtbundel met intensiteit valt door absorberend materiaal, zal het doorgelaten licht een lager
intensiteit hebben
• Transmissie:
• Absorbantie/Extinctie:
• Lineaire relatie tussen A en c van het absorberende staal:
ε = molaire absorptiecoëfficiënt ()
ð Handmatige berekening, in labo worden de exctinctiewaarden bekomen door de spectrophotometer
,1 Bepaal de extinctie bij 660 nm mbv spectrophotometer van de
- blanco (0)
- standaardoplossingen (1–7)
- onbekende oplossingen (8–10)
2 Trek de extinctiewaarde van de blanco (nr. 0) af van de extinctiewaarden van oplossingen 1-10
of
Stel de blanco als referentie (=0nm). Meet de waarden van oplossingen 1-10
2 Maak het gemiddelde van de extinctiewaarden van 8–10.
3 Zet de albumine-extinctiewaarden (1–7) uit in functie van de proteïneconcentraties (mg/l).
4 Bereken de proteïneconcentratie C van de onbekende oplossing (oplossing C) met behulp van deze ijkcurve
=> Vergelijking: y = ax + b, met y=extinctiewaarde en x=concentratie serumalbumine
-> door vergelijking om te vormen naar x met y=gemiddelde waarde onbekende oplossing serumalbumine, vind
je voor x de concentratie van de onbekende oplossing serumalbumine
ð Na de concentratie in het staal (c2) van de onbekende serumalbumineoplossing te berekenen, moet men de
concentratie berekenen van de onbekende serumalbumineoplossing in de STOCKoplossing (c1)
ð Mbv c1xV1 = c2 x V2
,2 PERIODAATOXIDATIE
A THEORIE
Doel: suikerbepaling adhv malaprade/periodaatoxidatie
SUIKERS OF KOOLHYDRATEN: belangrijkste energiebronnen voor zowel planten als dieren
• Algemene formule: (CH2O)n
• Enkelvoudig suiker of monosachariden: koolhydraat dat drie tot zeven koolstofatomen bevat
• 2 groepen:
Ketose: C=O in het midden
Aldose: C=O eindstandig
MALAPRADEREACTIE
In 1928 toonde Malaprade aan dat moleculen die vicinale hydroxylgroepen bezitten door periodaat geoxideerd
worden volgens reactieschema:
- Secundaire OH-groepen worden geoxideerd tot mierenzuur (HCOOH)
- Primaire OH-groepen (eindstandig) worden geoxideerd tot formaldehyde (CH2O)
Om de moleculen te oxideren zijn 5 splitsingen
nodig. Per splitsing wordt 1 molecule periodaat
verbruikt.
Men kan bepalen of een onbekende oplossing
een ketose of aldose is door deze oplossing te
laten reageren met een overmaat periodaat.
Door de verhoudign mierenzuur/periodaat te
bepalen kan men dit achterhalen.
B UITVOERING
VOORBEREIDING BLANCO EN ONBEKENDE (assistenten)
• Onbekende oplossing: 5 mL onbekende oplossing + 20mL periodaat
• Blanco oplossing: 5 mL H2O + 20mL periodaat
UITVOERING 2 TITRATIES
1 Na één week pipetteert men 1,00 ml van de onbekende in een erlenmeyer en voegt achtereenvolgens 5,0 ml
10% KI en ±3ml 1 M H2SO4 toe.
- KI zorgt voor vorming I2 1 mol IO4- = 1 mol I2
- H2SO4 dient als katalysator
,2 Titreer het vrijgestelde I2 met Na2S2O3 en enkele druppels zetmeeloplossing in het reactiemengsel. (Reactie 1)
Titreer tot de blauwe/bruinachtige kleur volledig verdwijnt.
-> I2 wordt omgezet in kleurloos I−
-> zodra al het I2 is omgezet, verdwijnt de blauwe/bruinachtige kleur
Herhaal vorige stappen nog een extra 2x met de onbekende en 2x met de blanco oplossing
3 Pipetteer in een tweede erlenmeyer 5,00 ml van de onbekende, en 1,0 ml ethyleenglycol (oplosmiddel)
4 Titreer na ± 10 min met 0,0500 M NaOH met fenolftaleïne als indicator. (Reactie 2)
De blanco wordt niet met NaOH getitreerd, enkel met Na2S2O3.
BEREKEN
• Het aantal mmol IO- verbruikt in 25,00 ml reactiemengsel.
4
1 Bereken het aantal mol Na2SO3 verbruikt mbv
- gegeven concentratie NA2SO3
- gebruikt volume tijdens de concentratie
2 Volgens reactie 1 is 1 mol I2 = 2 mol Na2SO3
-> deel bekomen mol Na2SO3 door 2. Dit is het verbruikt aantal mol I2
3 Bereken ook het verbruikt aantal mol I2 met de blanco als titrans
4 Trek het aantal verbruikte mol I2 van de onbekende af van het aantal vebruikte mol I2 van de blanco
-> Bij titratie met onbekende wordt 1 mol I2 minder gevormd dan bij titratie met blanco
-> Aantal mol I2 minder gevormd met onbekende als titrans
= aantal mol periodaat gevormd in erlenmeyer
= aantal mol periodaat verbruikt na de reactie
= aantal mol I2 verbruikt blanco – aantal mol I2 verbruikt onbekende
5 Vermenigvuldig het aantal verbruikte mol periodaat met 25
-> berekeningen waren voor toegevoegde blanco/onbekende 1mL
• Het aantal mmol HCOOH gevormd in 25,00 ml reactiemengsel
- Als verhouding dichter is bij 1
=> onbekende is aldose
- Als verhouding dichter is bij 0,6
=> onbekende is ketose
, 3 OPZUIVERING EN IDENTIFICATIE VAN DNA
A THEORIE
DNA
• Alle erfelijke informatie van een organisme ligt opgeslagen in het DNA
• Structuur:
- twee lange ketens van nucleotiden in dubbele helix
- ketens met elkaar verbonden via waterstofbruggen.
- vier verschillende nucleotiden met de nucleobasen
°adenine (A)
°cytosine (C)
°guanine (G)
°thymine (T)
• Strengen zijn complementair
-> basen kunnen alleen als basenparen (bp) AT en GC voorkomen
• Volgorde van nucleotiden bepaalt welke eiwitten er in het lichaam worden aangemaakt
PLASMIDE DNA
= cirkelvormige dubbele streng DNA die zich buiten het chromosomaal DNA bevindt
• De grootte van een plasmide: 1.000 - 200.000 baseparen
• Hiermee wisselen bacteriëen onderling genetische informatie
• kunnen in verschillende aantallen in een individuele cel of bacterie aanwezig zijn, variërend van één – honderden
• Plasmiden dragen altijd ten minste één gen
• Genen in een plasmide zijn meestal gunstig voor de ontvangende bacterie
-> kunnen er voor zorgen dat de bacterie nieuwe voedselbronnen kan aanspreken, gifstoffen kan aanmaken in
bepaalde omstandigheden of resistentie krijgt tegen bepaalde antibiotica
• Kan zich onafhankelijk repliceren
-> hiervoor bevat het plasmide ook een stuk DNA dat fungeert als startpunt voor replicatie
-> "origin of replication"
• Plasmiden die in een laboratorium artificieel worden aangemaakt bevatten ook steeds een selectiemarker
-> gen dat resistentie verschaft tegen een bepaald antibioticum (bv. ampicilline)
KUNSTMATIGE PLASMIDEN
• Worden vaak in biotechnologische en biomedische laboratoria gebruikt
-> genetische modificaties uitvoeren
-> nieuwe genen wroden ingebracth mbv restrictie-enzymen
• Zijn samengesteld uit stukken DNA die
- gewenste eigenschappen aan een cel kunnen toevoegen
Practicum biotechnologie en biochemie
1 PROTEINEBEPALING MET LOWRYMETHODE
A THEORIE
THEORIE
STRUCTUUR PROTEÏNEN / EIWITTEN: meest voorkomende organische moleculen in het menselijk lichaam
• Opgebouwd uit steeds weerkerende “motieven” van aminozuren (AZ)
- Structuur AZ:
° centraal C-stofatoom
° H-atoom
° aminogroep (-NH2)
° carbonzuurgroep (-COOH)
° variabele R-groep (of Rest-groep)
- AZ verbonden via peptidebindingen
-> N-terminus met C-terminus
• 4 verschillende niveaus in de structuur van eiwitten
1. Primaire structuur
= aminozuurvolgorde van het eiwit
2. Secundaire structuur
= plaatselijke ruimtelijke structuur die een bepaalde volgorde van aminozuren in een polypeptideketen
aanneemt (= α-helix en β-plaat)
3. Tertiaire structuur
= uiteindelijke driedimensionale vouwing van 1 polypeptideketen die ontstaat als verschillende delen van het
eiwit, elk met hun eigen secundaire structuur, bij elkaar komen
-> Hier vinden interacties plaats tussen zijketens AZ (H-bruggen, ionbindingen,..)
4. Quaternaire structuur
= manier waarop verschillende gevouwen polypeptideketens bij elkaar komen in de uiteindelijke eiwitstructuur
FUNCTIES VAN EIWITTEN
• Vorm en structuur van cellen en weefsels (bv. keratine,collageen)
• Beweging (bv. actine- en myosinefilamenten)
• Transport (bv. albumine, hemoglobine)
• Enzymen (bv. amylase, pepsidase)
• Hormonen (bv. insuline)
• Verdediging (bv. antilichamen)
=> Verlies van eiwitten kan leiden tot onherstelbareschade aan organen en orgaanstelsels
DENATURATIE
• Wat?
- verlies van de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur
- primaire structuur blijft behouden
• Oorzaak? Tabel
• Gevolg? Functieverlies eiwit
,B PRAKTIJK
A VERDUNNINGSREEKS PROTEÏNE MAKEN: LOWRY-METHODE
Lowrymethode
= gevoelige colorimetrische assay => 2 kleurvormende reacties => verhoging van de gevoeligheid
1 Breng in verschillende proefbuizen de volumes (in ml) zoals weergegeven in onderstaande tabel:
• Oplossing A: NaOH (0,5 M),
CuSO4 (0,05%), Na2CO3 (10%),
NaK-C4H4O64H2O (Natrium
kaliumtartraat) (0,1%)
Opgelet! Cu++ is giftig!
• Oplossing B: waterigeoplossing van het
serumalbumine (200mg/l)
• Oplossing C: onbekende oplossing van
serumalbumine
2 Meng telkens, laat de oplossing 10 minuten bij kamertemperatuur staan.
=> Kleurreactie 1: Proteïne (oplossing B of C) + Cu2+ (oplossing A) => complexatie Cu2+ met peptidebindingen
-> in aanwezigheid van een base (NaOH) en natrium kaliumtartraat, met de peptidebindingen
-> diep blauwe kleur
3 Voeg aan elke proefbuis 4 ml Folin-Ciocalteureagens toe (oplossing D)
=> Kleurreactie 2: Proteïne + Folin- ciocalteureagens (oplossing D) => reductie fosfomolybdaat
-> reductie door reactie met tyrosine en tryptofaan in de proteïneketen
-> diep blauwe kleur
4 Meng goed door omzwenken (gebruik parafilm)
5 Laat de oplossing minimum 30 minuten bij kamertemperatuur staan.
B SPECTROFOTOMETRIE: LAMBERT-BEER
Lambert-Beer
= wanneer een lichtbundel met intensiteit valt door absorberend materiaal, zal het doorgelaten licht een lager
intensiteit hebben
• Transmissie:
• Absorbantie/Extinctie:
• Lineaire relatie tussen A en c van het absorberende staal:
ε = molaire absorptiecoëfficiënt ()
ð Handmatige berekening, in labo worden de exctinctiewaarden bekomen door de spectrophotometer
,1 Bepaal de extinctie bij 660 nm mbv spectrophotometer van de
- blanco (0)
- standaardoplossingen (1–7)
- onbekende oplossingen (8–10)
2 Trek de extinctiewaarde van de blanco (nr. 0) af van de extinctiewaarden van oplossingen 1-10
of
Stel de blanco als referentie (=0nm). Meet de waarden van oplossingen 1-10
2 Maak het gemiddelde van de extinctiewaarden van 8–10.
3 Zet de albumine-extinctiewaarden (1–7) uit in functie van de proteïneconcentraties (mg/l).
4 Bereken de proteïneconcentratie C van de onbekende oplossing (oplossing C) met behulp van deze ijkcurve
=> Vergelijking: y = ax + b, met y=extinctiewaarde en x=concentratie serumalbumine
-> door vergelijking om te vormen naar x met y=gemiddelde waarde onbekende oplossing serumalbumine, vind
je voor x de concentratie van de onbekende oplossing serumalbumine
ð Na de concentratie in het staal (c2) van de onbekende serumalbumineoplossing te berekenen, moet men de
concentratie berekenen van de onbekende serumalbumineoplossing in de STOCKoplossing (c1)
ð Mbv c1xV1 = c2 x V2
,2 PERIODAATOXIDATIE
A THEORIE
Doel: suikerbepaling adhv malaprade/periodaatoxidatie
SUIKERS OF KOOLHYDRATEN: belangrijkste energiebronnen voor zowel planten als dieren
• Algemene formule: (CH2O)n
• Enkelvoudig suiker of monosachariden: koolhydraat dat drie tot zeven koolstofatomen bevat
• 2 groepen:
Ketose: C=O in het midden
Aldose: C=O eindstandig
MALAPRADEREACTIE
In 1928 toonde Malaprade aan dat moleculen die vicinale hydroxylgroepen bezitten door periodaat geoxideerd
worden volgens reactieschema:
- Secundaire OH-groepen worden geoxideerd tot mierenzuur (HCOOH)
- Primaire OH-groepen (eindstandig) worden geoxideerd tot formaldehyde (CH2O)
Om de moleculen te oxideren zijn 5 splitsingen
nodig. Per splitsing wordt 1 molecule periodaat
verbruikt.
Men kan bepalen of een onbekende oplossing
een ketose of aldose is door deze oplossing te
laten reageren met een overmaat periodaat.
Door de verhoudign mierenzuur/periodaat te
bepalen kan men dit achterhalen.
B UITVOERING
VOORBEREIDING BLANCO EN ONBEKENDE (assistenten)
• Onbekende oplossing: 5 mL onbekende oplossing + 20mL periodaat
• Blanco oplossing: 5 mL H2O + 20mL periodaat
UITVOERING 2 TITRATIES
1 Na één week pipetteert men 1,00 ml van de onbekende in een erlenmeyer en voegt achtereenvolgens 5,0 ml
10% KI en ±3ml 1 M H2SO4 toe.
- KI zorgt voor vorming I2 1 mol IO4- = 1 mol I2
- H2SO4 dient als katalysator
,2 Titreer het vrijgestelde I2 met Na2S2O3 en enkele druppels zetmeeloplossing in het reactiemengsel. (Reactie 1)
Titreer tot de blauwe/bruinachtige kleur volledig verdwijnt.
-> I2 wordt omgezet in kleurloos I−
-> zodra al het I2 is omgezet, verdwijnt de blauwe/bruinachtige kleur
Herhaal vorige stappen nog een extra 2x met de onbekende en 2x met de blanco oplossing
3 Pipetteer in een tweede erlenmeyer 5,00 ml van de onbekende, en 1,0 ml ethyleenglycol (oplosmiddel)
4 Titreer na ± 10 min met 0,0500 M NaOH met fenolftaleïne als indicator. (Reactie 2)
De blanco wordt niet met NaOH getitreerd, enkel met Na2S2O3.
BEREKEN
• Het aantal mmol IO- verbruikt in 25,00 ml reactiemengsel.
4
1 Bereken het aantal mol Na2SO3 verbruikt mbv
- gegeven concentratie NA2SO3
- gebruikt volume tijdens de concentratie
2 Volgens reactie 1 is 1 mol I2 = 2 mol Na2SO3
-> deel bekomen mol Na2SO3 door 2. Dit is het verbruikt aantal mol I2
3 Bereken ook het verbruikt aantal mol I2 met de blanco als titrans
4 Trek het aantal verbruikte mol I2 van de onbekende af van het aantal vebruikte mol I2 van de blanco
-> Bij titratie met onbekende wordt 1 mol I2 minder gevormd dan bij titratie met blanco
-> Aantal mol I2 minder gevormd met onbekende als titrans
= aantal mol periodaat gevormd in erlenmeyer
= aantal mol periodaat verbruikt na de reactie
= aantal mol I2 verbruikt blanco – aantal mol I2 verbruikt onbekende
5 Vermenigvuldig het aantal verbruikte mol periodaat met 25
-> berekeningen waren voor toegevoegde blanco/onbekende 1mL
• Het aantal mmol HCOOH gevormd in 25,00 ml reactiemengsel
- Als verhouding dichter is bij 1
=> onbekende is aldose
- Als verhouding dichter is bij 0,6
=> onbekende is ketose
, 3 OPZUIVERING EN IDENTIFICATIE VAN DNA
A THEORIE
DNA
• Alle erfelijke informatie van een organisme ligt opgeslagen in het DNA
• Structuur:
- twee lange ketens van nucleotiden in dubbele helix
- ketens met elkaar verbonden via waterstofbruggen.
- vier verschillende nucleotiden met de nucleobasen
°adenine (A)
°cytosine (C)
°guanine (G)
°thymine (T)
• Strengen zijn complementair
-> basen kunnen alleen als basenparen (bp) AT en GC voorkomen
• Volgorde van nucleotiden bepaalt welke eiwitten er in het lichaam worden aangemaakt
PLASMIDE DNA
= cirkelvormige dubbele streng DNA die zich buiten het chromosomaal DNA bevindt
• De grootte van een plasmide: 1.000 - 200.000 baseparen
• Hiermee wisselen bacteriëen onderling genetische informatie
• kunnen in verschillende aantallen in een individuele cel of bacterie aanwezig zijn, variërend van één – honderden
• Plasmiden dragen altijd ten minste één gen
• Genen in een plasmide zijn meestal gunstig voor de ontvangende bacterie
-> kunnen er voor zorgen dat de bacterie nieuwe voedselbronnen kan aanspreken, gifstoffen kan aanmaken in
bepaalde omstandigheden of resistentie krijgt tegen bepaalde antibiotica
• Kan zich onafhankelijk repliceren
-> hiervoor bevat het plasmide ook een stuk DNA dat fungeert als startpunt voor replicatie
-> "origin of replication"
• Plasmiden die in een laboratorium artificieel worden aangemaakt bevatten ook steeds een selectiemarker
-> gen dat resistentie verschaft tegen een bepaald antibioticum (bv. ampicilline)
KUNSTMATIGE PLASMIDEN
• Worden vaak in biotechnologische en biomedische laboratoria gebruikt
-> genetische modificaties uitvoeren
-> nieuwe genen wroden ingebracth mbv restrictie-enzymen
• Zijn samengesteld uit stukken DNA die
- gewenste eigenschappen aan een cel kunnen toevoegen
