Samenvatting Deel 2 Moleculaire Technieken

Genoom deel 2 Moleculaire technieken

** Alle afbeeldingen uit deze weergave komen uit bronnen van het UMC Utrecht **

Week 7
HC Technieken: DNA, RNA
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces in de cel (= in levende omgeving): in vivo
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces uit de cel halen en bestuderen in een reageerbuis: in vitro

DNA-analyse technieken:
1. PCR
2. Restrictie-enzymen
3. DNA-gelelectroforese
4. Sanger sequencing: dideoxy sequencing
5. Next generation sequencing (week 9)

RNA-analyse technieken:
1. (In-situ) hybridization
2. cDNA maken
3. Kwantitatieve RT-PCR
4. RNAseq (RNA sequencing) (week 9)

Basisprincipe in veel DNA/RNA-analysetechnieken is hybridisatie.
1. Denaturatie: dubbelstrengs  enkelstrengs DNA of RNA
2. Renaturatie: enkelstrengs  dubbelstrengs DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
3. Gebruik van primer/probe/oligo: enkelstrengs DNA voor detectie van complementair gebied
a. 20 nt is uniek


DNA-analyse
PCR
Twee doelen:
1) Selecteren van een sequentie
2) Amplificeren van een sequentie

Proces:
Selecteren specifieke, dubbelstrengse sequentie en heel vaak amplificeren. Uit elkaar halen strengen door
hele hoge temperatuur. Daarna gebruik van 2 primers: forward en reverse primer, dezelfde sequentie maar
ene is in spiegelbeeld van 3’ naar 5’. Primers binden aan 3’ van target sequentie (3’  5’): daarna m.b.v.
DNA-polymerase repliceren sequentie; de primer bevindt zich dus in de geamplificeerde sequentie. Na 1 e
paar cycli 2 dubbelstrengs DNA-moleculen die de sequentie bevatten, zijn geproduceerd. Uiteindelijk ook
productie van DNA-fragment van alleen specifieke sequentie, die daarna weer wordt geamplificeerd: zorgt
voor exponentiële toename.

PCR primers: complementair, specifiek en binden aan de grenzen van het DNA-fragment van interesse.
Benodigdheden voor PCR:
- Primers
- Nucleotiden
- DNA-polymerase
- DNA template
- Thermocycler: PCR machine

,Voorwaarden voor uitvoeren PCR:
- De uiteinden van het te vermeerderen stuk moeten bekend zijn
- Het stuk dat je wilt vermeerderen kan max. enkele duizenden bp groot zijn (tussen start en stop)

Restrictie-enzymen (endonucleases)
- Restrictie-enzym herkent sequentie in dsDNA
(dubbelstreng)
- Herkenning meestal via een symmetrische
sequentie
- Enzymen binden vaak als dimeer
o Verschil lineair en circulair DNA
 Lineair DNA:
 1x knippen = 2 fragmenten
 2x knippen = 3 fragmenten
 Circulair DNA:
 1x knippen = 1 fragment
 2x knippen = 2 fragmenten
- Door restrictie-enzymen kunnen er verschillende soorten uiteinden van de breuk ontstaan:
o Sticky 5’ end: overhang
o Sticky 3’ end: overhang (EcoRi, Hindlll)
o Blunt ends (Haelll): d.w.z. stomp, zowel het forward als reverse DNA-uiteinde zijn even lang

DNA-gelelectroforese
- Scheiding DNA-fragmenten op basis van grootte
o Gel werkt als een soort zeef/net
- Het patroon van DNA-fragmenten wordt de DNA-ladder genoemd
- Door een marker toe te voegen in 1 van de openingen, waar fragmenten van verschillende grootte
in zitten waarvan de grootte bekend is, creëer je een referentie: zo kun je de onbekende grootte van
de fragmenten afleiden door te kijken naar de plaats t.o.v. de marker in de gel
- Fragmenten migreren van – naar + pool
o DNA is negatief geladen
- Kleinste (in grootte) fragmenten migreren het snelste naar + pool
- DNA-fragmenten zijn net als gel bijna doorzichtig: DNA zichtbaar maken in gel m.b.v.:
o Ethiumbrome en UV-licht
o Radioactief 32P-gelabelde nucleotiden
o Fluorescent gelabelde nucleotiden
 Radioactief en fluorescent labelen zie Sanger sequencing

Dideoxy (Sanger) sequencing
Begin met PCR-reactie: DNA-fragment amplificeren
Verdelen over 4 reageerbuisjes en aan elk van de buisjes kleine hoeveelheid van 1 soort ddNTP toevoegen:
ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP = dideoxy d.w.z. i.p.v. OH, H-groep
In reageerbuisje vindt polymerase plaats van nieuwe DNA-fragmenten: als bij de polymerisatie door DNA-
polymerase i.p.v. dATP, een ddATP wordt ingebouwd, stop de verlenging van de DNA-streng: er kunnen
geen nieuwe nucleotiden meer worden ingebouwd. Door middel van gelelectroforese worden de
verschillende lengten DNA-fragmenten die hierdoor ontstaan van elkaar gescheiden.
- Zichtbaar maken DNA-fragmenten in gel bij Dideoxy sequencing door fluorescentie of radioactiviteit
o Ieder ddNTP heeft een eigen fluorescerende kleur
- Verhouding dNTP/ddNTP is belangrijk

, RNA-analyse
DNA/RNA-analyse o.b.v. hybridisatie + fluorescentie
- FISH: fluorescentie-in-situ-hybridisatie
o Om locatie van DNA-sequenties op mitotische chromosomen zichtbaar te maken
- In-situ hybridisatie
o Om aanwezigheid van specifieke RNA’s in bepaalde weefsels zichtbaar te maken (bijv.
muizenhersenen)

cDNA maken
Met behulp van reverse transcriptase en poly-T-primer: alle mRNA’s omzetten in dubbelstrengs DNA
- Poly-T-primer: alleen mRNA’s hebben een poly-A-staart, binden A-staart met T-primer
- Functies poly-T-primer:
o Startpunt voor reverse transcriptase ( primer)
o Alleen dubbelstrengs maken mRNA’s: andere soorten RNA hebben geen poly-A-staart
(herkenning mRNA’s)
Welke cDNA’s dit oplevert, is dus afhankelijk van de aanwezige mRNA’s: dit is dus variabel per weefsel en
conditie (momentopname)

Kwantitatieve RT-PCR
RT: reverse transcriptase
 Via PCR bepalen of een bepaald mRNA heel veel of juist heel weinig aanwezig was in de cel. Meten van
de fluorescentie tegen de tijd (aantal PCR-cycli en dus amplificatie van sequentie)
- Naarmate hoeveelheid dsDNA-fragmenten stijft, neemt de fluorescentie toe
- Hoe hoger de concentratie van een specifiek mRNA bij aanvang, hoe minder cycli er nodig zijn om
de maximale fluorescentie te bereiken
- Aantal benodigde cycli is een maat voor hoeveelheid mRNA

Efficiëntie van de technieken
Elk van deze analysetechnieken heeft zijn beperkingen: het doel is om de aanwezigheid van een sequentie,
de sequentie zelf, de hoeveelheid en de locatie van de sequentie te bepalen.
DNA:
1. PCR: aanwezigheid
2. Restrictie-enzymen: aanwezigheid
3. DNA-gelectroforese: aanwezigheid
4. Sanger sequencing (dideoxy): sequentie
5. Next generation sequencing (tijdens WC): sequentie
RNA:
1. (in-situ) hybridisatie: aanwezigheid, locatie
2. cDNA maken: aanwezigheid, sequentie (na sequencing)
3. Kwantitatieve RT-PCR: hoeveelheid
4. RNA-sequencing (RNAseq) (week 9): aanwezigheid/hoeveelheid/sequentie