Immunologie Praktijk 11
BMLIMP11
Opleiding Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek
Instituut EAS
Hogeschool Rotterdam
Maart 2016 (VERSIE 3)
Auteur/samenstellers: E.J.E. Ouwendijk, M.H.A. van der Wardt en R. Bax
Cursushouder: Meike Hensmann, M.H.A. van der Wardt
1
,Inhoud
Inleiding ................................................................................................................................................... 3
Prakticumopzet IMP11 ............................................................................................................................ 7
Nomenclatuur van de immuunregentia .................................................................................................. 8
A Aantonen van IgM d.m.v. gelelectroforese en Western Blotting ...................................................... 9
B Bepaling van de concentratie Lysozym d.m.v. competitieve ELISA.................................................. 17
C Bepaling van de titer en concentratie IgM-reumafactoren in menselijk serum d.m.v. ELISA ..... 20
D Bepaling van optimale verdunningen in ELISA d.m.v. schaakbordtitraties .................................. 24
E Immunofluorescentiemicroscopie ................................................................................................ 26
F Bepaling complementactiviteit ..................................................................................................... 32
G Analyse van celpopulaties m.b.v. FACS analysis ........................................................................... 35
H Aantonen van anti-nucleaire antilichamen in serum .................................................................... 37
I Opdracht Immuunhistochemie ..................................................................................................... 55
Bijlage 1 Regels voor de verslaglegging bij practica voor de opleiding BML ................................... 60
Bijlage 2 Verdiepingsliteratuur ........................................................................................................ 63
Bijlage 3 Voorbereidingsvragen ....................................................................................................... 64
Bijlage 4 Voorbeeldvragen van theoretische deel van labjournaaltoets. ........................................ 65
Bijlage 5 Informatie over te gebruiken antigenen en antilichamen per experiment. ..................... 66
2
,Inleiding
In deze module wordt praktische kennis opgedaan over een aantal veel gebruikte immunochemische analyses in de
klinische diagnostiek en research. Telkens worden hierbij antilichamen gebruikt om kwantitatief en kwalitatief
specifieke eiwitten aan te tonen in humaan serum en in cellen.
IgM zal worden aangetoond met gelectroforese en Western immunoblotting. Daarbij zal, indien mogelijk, gelet worden
op de specificiteit, snelheid, kruisreactiviteit en gevoeligheid van de bepalingen. Serologische diagnostiek van
reumatoïde arthritis (reuma) zal worden gedaan met behulp van een ELISA en de lysozymconcentratie zal worden
bepaald met een andere variant namelijk de competitieve ELISA. Om te laten zien dat men antilichamen tegen
lichaamseigen eiwitten in celkernen microscopisch kan aantonen, is er een protocol opgenomen waarbij met
fluorescentiemicroscopie antigenen worden aangetoond. De theoretische achtergronden van fluorescentie worden
bestudeerd aan de hand van een werkblad en aanwezige apparatuur en literatuur.
Er wordt kennis gemaakt met de achtergronden van flowcytometrie uitmondend in de analyse van FACS histogrammen
en dot-plots. De bepaling van de complementactiviteit d.m.v. het vaststellen van de CH-50 waarde zal de overige tijd in
beslag nemen.
Steeds zal worden aangegeven waar de technische uitvoeringskneepjes zitten in de gebruikte technieken.
Begineisen
Deze module dient gelijktijdig gevolgd te worden met (of is reeds voorafgegaan door) de theorie module BMLIMM12.
Studiebelasting
De studiebelasting voor de module IMP11 is 84 sbu.
De module bestaat uit 8 x 50 minuten aaneengesloten contacttijd per week gedurende 4 weken.
Bij voldoende beoordeling worden 3 ECTS toegekend.
Studie activiteiten
Prakticumdag 2 t/m 4 zullen begonnen worden met nabespreking van de voorbereidingsvragen, die te vinden zijn in
bijlage 3. De antwoorden op de voorbereidingsvragen moeten voor de betreffende prakticumdag in N@tschool worden
ingeleverd. Dit is voorwaarde voor deelname aan betreffend prakticumonderdeel.
Van een paar praktica wordt een kort rapport of een verslag verlangd. Deze schriftelijke stukken moeten ook in
N@tschool worden ingeleverd, uiterlijk één werkdag voor het vastgestelde datum voor de eindtoets. Dit is voorwaarde
voor deelname aan de eindtoets. Eisen waaraan een meetrapport of verslag moet voldoen staan in bijlage 1.
Gedurende prakticumdag 4 wordt een rekenopdracht gegeven. Getoetst wordt of men in staat is juiste verdunningen te
berekenen.
Tot slot wordt over IMP11 een eindtoets afgenomen over het labjournaal inclusief rapport + verslag, en de theoretische
achtergronden van de uitgevoerde experimenten. Voorts wordt getoetst of men in staat is kritische varianten te
bedenken op bestaande proeven en hiervoor de juiste reagentia aan te geven. Bij de eindtoets mag de modulewijzer
niet worden geraadpleegd.
Leermiddelen
1. Modulewijzer IMP11
2. Modulewijzer IMM12
3. Nester, E.W. Microbiology, McGraw-Hill, Boston
4. Reed, R. et al. Practical Skills in Biomolecular Sciences, Pearson, Harlow England.
3
, Leerdoelen
- Gelelectroforese en Western blotting uitvoeren en achtergrond begrijpen.
- Competitieve ELISA uitvoeren en achtergrond begrijpen.
- Reuma ELISA uitvoeren en achtergrond begrijpen.
- Resultaten van een schaakbordtitratie kunnen interpreteren.
- Achtergronden van immunofluorescentie microscopie begrijpen en preparaten met fluorochroom label
analyseren m.b.v. de fluorescentiemicroscoop
- Complement activiteit bepalen en achtergrond begrijpen.
- Resultaten van een FACS analyse kunnen interpreteren.
- Anti nucleaire antilichamen aantonen in patiëntenserum.
- Immuunhistochemie achtergrond begrijpen.
- Resultaten rapporteren volgens de in de opleiding geldende richtlijnen.
Toetsing
Het labjournaal inclusief complement-rapport en opdrachten en de observatie van de uitvoering van de
experimenten worden alleen formatief beoordeeld (hier wordt feedback op gegeven).
De summatieve beoordeling (voor de bepaling van het eindcijfer) vindt plaats aan de hand van de volgende
onderdelen:
Het rheuma verslag
De eindtoets (theoretische + praktische deel)
Toetsmatrijs
Eindtoets Rheuma Labjournaal, Observatie
Toetsvorm verslag meetrapport, uitvoering
opdrachten
Weging/ Weging/
Bijdrage Bijdrage
Leerdoel / aan cijfer aan cijfer
Thema A B
Gelelectroforese en 5-10% Feedback Feedback
Western Blotting
Competitieve ELISA 10-20% Feedback Feedback
Rheuma ELISA 10-20% 50 % Feedback Feedback
Schaakbordtitratie 10-20% Feedback
Immunofluores- 10-20% Feedback
centiemicroscopie
Complement- 10-20% Feedback Feedback
activiteit bepalen
FACS analyse 10-20% Feedback
Aantonen van 10-20% Feedback Feedback
anti-nucleaire
antilichamen in
serum
Opdracht 5-10% Feedback
Immuunhistochemie
Resultaten 50%
rapporteren
4
BMLIMP11
Opleiding Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek
Instituut EAS
Hogeschool Rotterdam
Maart 2016 (VERSIE 3)
Auteur/samenstellers: E.J.E. Ouwendijk, M.H.A. van der Wardt en R. Bax
Cursushouder: Meike Hensmann, M.H.A. van der Wardt
1
,Inhoud
Inleiding ................................................................................................................................................... 3
Prakticumopzet IMP11 ............................................................................................................................ 7
Nomenclatuur van de immuunregentia .................................................................................................. 8
A Aantonen van IgM d.m.v. gelelectroforese en Western Blotting ...................................................... 9
B Bepaling van de concentratie Lysozym d.m.v. competitieve ELISA.................................................. 17
C Bepaling van de titer en concentratie IgM-reumafactoren in menselijk serum d.m.v. ELISA ..... 20
D Bepaling van optimale verdunningen in ELISA d.m.v. schaakbordtitraties .................................. 24
E Immunofluorescentiemicroscopie ................................................................................................ 26
F Bepaling complementactiviteit ..................................................................................................... 32
G Analyse van celpopulaties m.b.v. FACS analysis ........................................................................... 35
H Aantonen van anti-nucleaire antilichamen in serum .................................................................... 37
I Opdracht Immuunhistochemie ..................................................................................................... 55
Bijlage 1 Regels voor de verslaglegging bij practica voor de opleiding BML ................................... 60
Bijlage 2 Verdiepingsliteratuur ........................................................................................................ 63
Bijlage 3 Voorbereidingsvragen ....................................................................................................... 64
Bijlage 4 Voorbeeldvragen van theoretische deel van labjournaaltoets. ........................................ 65
Bijlage 5 Informatie over te gebruiken antigenen en antilichamen per experiment. ..................... 66
2
,Inleiding
In deze module wordt praktische kennis opgedaan over een aantal veel gebruikte immunochemische analyses in de
klinische diagnostiek en research. Telkens worden hierbij antilichamen gebruikt om kwantitatief en kwalitatief
specifieke eiwitten aan te tonen in humaan serum en in cellen.
IgM zal worden aangetoond met gelectroforese en Western immunoblotting. Daarbij zal, indien mogelijk, gelet worden
op de specificiteit, snelheid, kruisreactiviteit en gevoeligheid van de bepalingen. Serologische diagnostiek van
reumatoïde arthritis (reuma) zal worden gedaan met behulp van een ELISA en de lysozymconcentratie zal worden
bepaald met een andere variant namelijk de competitieve ELISA. Om te laten zien dat men antilichamen tegen
lichaamseigen eiwitten in celkernen microscopisch kan aantonen, is er een protocol opgenomen waarbij met
fluorescentiemicroscopie antigenen worden aangetoond. De theoretische achtergronden van fluorescentie worden
bestudeerd aan de hand van een werkblad en aanwezige apparatuur en literatuur.
Er wordt kennis gemaakt met de achtergronden van flowcytometrie uitmondend in de analyse van FACS histogrammen
en dot-plots. De bepaling van de complementactiviteit d.m.v. het vaststellen van de CH-50 waarde zal de overige tijd in
beslag nemen.
Steeds zal worden aangegeven waar de technische uitvoeringskneepjes zitten in de gebruikte technieken.
Begineisen
Deze module dient gelijktijdig gevolgd te worden met (of is reeds voorafgegaan door) de theorie module BMLIMM12.
Studiebelasting
De studiebelasting voor de module IMP11 is 84 sbu.
De module bestaat uit 8 x 50 minuten aaneengesloten contacttijd per week gedurende 4 weken.
Bij voldoende beoordeling worden 3 ECTS toegekend.
Studie activiteiten
Prakticumdag 2 t/m 4 zullen begonnen worden met nabespreking van de voorbereidingsvragen, die te vinden zijn in
bijlage 3. De antwoorden op de voorbereidingsvragen moeten voor de betreffende prakticumdag in N@tschool worden
ingeleverd. Dit is voorwaarde voor deelname aan betreffend prakticumonderdeel.
Van een paar praktica wordt een kort rapport of een verslag verlangd. Deze schriftelijke stukken moeten ook in
N@tschool worden ingeleverd, uiterlijk één werkdag voor het vastgestelde datum voor de eindtoets. Dit is voorwaarde
voor deelname aan de eindtoets. Eisen waaraan een meetrapport of verslag moet voldoen staan in bijlage 1.
Gedurende prakticumdag 4 wordt een rekenopdracht gegeven. Getoetst wordt of men in staat is juiste verdunningen te
berekenen.
Tot slot wordt over IMP11 een eindtoets afgenomen over het labjournaal inclusief rapport + verslag, en de theoretische
achtergronden van de uitgevoerde experimenten. Voorts wordt getoetst of men in staat is kritische varianten te
bedenken op bestaande proeven en hiervoor de juiste reagentia aan te geven. Bij de eindtoets mag de modulewijzer
niet worden geraadpleegd.
Leermiddelen
1. Modulewijzer IMP11
2. Modulewijzer IMM12
3. Nester, E.W. Microbiology, McGraw-Hill, Boston
4. Reed, R. et al. Practical Skills in Biomolecular Sciences, Pearson, Harlow England.
3
, Leerdoelen
- Gelelectroforese en Western blotting uitvoeren en achtergrond begrijpen.
- Competitieve ELISA uitvoeren en achtergrond begrijpen.
- Reuma ELISA uitvoeren en achtergrond begrijpen.
- Resultaten van een schaakbordtitratie kunnen interpreteren.
- Achtergronden van immunofluorescentie microscopie begrijpen en preparaten met fluorochroom label
analyseren m.b.v. de fluorescentiemicroscoop
- Complement activiteit bepalen en achtergrond begrijpen.
- Resultaten van een FACS analyse kunnen interpreteren.
- Anti nucleaire antilichamen aantonen in patiëntenserum.
- Immuunhistochemie achtergrond begrijpen.
- Resultaten rapporteren volgens de in de opleiding geldende richtlijnen.
Toetsing
Het labjournaal inclusief complement-rapport en opdrachten en de observatie van de uitvoering van de
experimenten worden alleen formatief beoordeeld (hier wordt feedback op gegeven).
De summatieve beoordeling (voor de bepaling van het eindcijfer) vindt plaats aan de hand van de volgende
onderdelen:
Het rheuma verslag
De eindtoets (theoretische + praktische deel)
Toetsmatrijs
Eindtoets Rheuma Labjournaal, Observatie
Toetsvorm verslag meetrapport, uitvoering
opdrachten
Weging/ Weging/
Bijdrage Bijdrage
Leerdoel / aan cijfer aan cijfer
Thema A B
Gelelectroforese en 5-10% Feedback Feedback
Western Blotting
Competitieve ELISA 10-20% Feedback Feedback
Rheuma ELISA 10-20% 50 % Feedback Feedback
Schaakbordtitratie 10-20% Feedback
Immunofluores- 10-20% Feedback
centiemicroscopie
Complement- 10-20% Feedback Feedback
activiteit bepalen
FACS analyse 10-20% Feedback
Aantonen van 10-20% Feedback Feedback
anti-nucleaire
antilichamen in
serum
Opdracht 5-10% Feedback
Immuunhistochemie
Resultaten 50%
rapporteren
4
