Theorie voor de praktijk immunologie
Aantekeningen lesweek 1
Tijdens celkweek gaan we door met de dierlijke celkweek. Cellen passeren/doorzetten (dit
betekent dat je de cellen van één flesje doorzet naar de andere met verdunningen).
Belangrijk bij celkweek is dat de cellen worden onderhouden in een steriele omgeving (een
besmetting heeft ongewenste invloed op je cellen). We werken in een downflow. Belangrijk is
nauwkeurig, netjes en steriel werken omdat de grootste besmetting je zelf bent (gisten van
brood aan de handen, cellen op de handen, etc.). Afval dierlijke cellen is biohazard afval
(bijzetten bij voorbereiding). Ook gevaarlijke stoffen opzoeken. Van te voren berekenen 50 ml
celcultuur.
Hechtende cellen. Monolayer is een één lagige cel. Als cellen tegen elkaar aankomen dan
stoppen ze met groeien. Ze groeien dus maximaal over de oppervlak van het flesje. Cellen
groeien (hetzelfde als bij bacteriën). Lag fase, log fase, stationaire fase en de dode fase. We
willen alleen in de log fase de cellen bewaren (in de exponentiële fase). Daarom twee keer
per week de cellen doorzetten. Als ze al in de stationaire fase zijn dan is het heel moeilijk om
ze terug te krijgen naar de logfase. Het is van belang om de cellen door te zetten voordat ze
de 100 procent confluentie (als ze helemaal dicht tegen elkaar aanliggen). Bij 100%
confluentie heb je al te maken met de stationaire fase en daarna afstervingsfase. Dus bij
80% al doorzetten!
We kweken cellen in de 6-wellsplaten of in de flessen. Rode spul in 6-wellsplaten is het
medium (rood is de pH indicator, geeft aan dat het de goede pH heeft (meestal ligt die pH
rond de 7). Dierlijke cellen zijn veel gevoeliger voor pH verandering dan bacteriële cellen.
T25, T75 en T175 staat voor de oppervlakte (in vierkante cm). Oppervlakte is belangrijk voor
de groei. Hoe meer cellen hoe een groter oppervlak je gebruikt. Verder worden plastic
pipetten gebruikt. Deze dienen steriel gehouden te worden (niet aanraken met de handen).
Filmpje is heel belangrijk voor thematoets. Functies die worden verteld moet je kennen.
Aandachtspunten filmpje. Vloeistoffen dienen te worden toegevoegd bij 37 graden. Spullen
moet worden gedesinfecteerd met 70% ethanol. Het is van belang dat je een overzichtelijk
ingedeelde werkruimte hebt, bij voorkeur in het midden van de flowkast. Cellen van tevoren
onder de microscoop controleren (labjournaal).
Passeren/doorzetten van cellen. Een volle laag van cellen = monolayer of 100% confluentie.
De exponentiële groeifase vóór 100% confluentie; bij 100% confluentie heb je de stationaire
fase en daarna de afstervingsfase.
Medium. MEM en DMEM worden veel gebruikt. Maar ook IMDM en RPMI. Noteren in je
labjournaal welk medium je gebruikt. Er zijn veel aanpassingen voor verschillende celtypes.
- Aminozuren, vitamines, inorganische zouten, glucose (bron van energie).
- Vaak wordt serum toegevoegd, bijvoorbeeld van een foetaal kalf (bron van groeifactoren,
hormonen, mineralen en lipiden).
- Antibiotica, glutamine, hormone en groeifactoren.
- Serum-vrij medium, geconditioneerd medium.
- pH indicatoren (paars is hij basisch, geel is hij zuur).
→ Besmettingen. Bronnen van besmetting zijn, incubator, waterbad, materialen en
aseptische technieken. Detectie, ze kunnen zowel microscopisch als macroscopisch getest
worden.
* Bacteriën. Hierbij kan een plotselinge pH wisseling plaatsvinden (medium geel). Onder de
microscoop zie je dode cellen (rond en drijvend). Macroscopisch zie je kleine korrels
(coccen/staafjes in de fles).
* Mycoplasma. Dit is een zeer kleine bacterie (0,1 micrometer) en heeft geen celwand.
Mycoplasma is slecht te ontdekken, maar schadelijk voor cellijn/experiment. Er is dan
slechte groei aanwezig. Cellijnen dienen regelmatig getest te worden op mycoplasma
infecties.
* Gisten. Bij gisten is er geen pH verandering. Het medium blijft roze/rood. Wel is er een
, melkachtige neerslag in de kweekfles en hij is troebel. Onder de microscoop zijn ronde of
ovale deeltjes, kleiner dan cellen te zien.
* Schimmels. Ook hierbij treedt geen pH verandering op. Wel is er een slecht groeiende
cellijn. Onder de microscoop zijn kluwen van schimmeldraden te zien.
Flow cytometrie. Analyseert stroom (flow) van cellen (cyto) in druppels. Door lasers te richten
op de stroom. De uitleg/principe hiervan zal worden gedaan tijdens de immunologie les. De
uitleg van de data-analyse zal plaatsvinden tijdens de data-analyse les (programma op usb
zetten).
Flowcytometrie experiment. Hierbij test je op je cellen CD4+ of CD8+ zijn (fluorscent
gelabelde antilichamen tegen CD4 en CD8). Zoek op internet op wat DO11.10 cellen zijn en
verwerk dat in de hypothese.
Aantekeningen filmpje celkweek.
Trypsine niet in het waterbad plaatsen. Met behulp van het enzym trypsine worden de cellen
van elkaar en van de kweekfles losgeknipt. Het medium dat bij de cellen zit bevat FCS, wat
de werking van trypsine verminderd. Daarom worden de cellen eerst met PBS gewassen om
het oude kweekmedium met de FCS te verwijderen. Ook worden op deze manier dode cellen
die ronddrijven in het medium weggewassen. Trypsine is een enzym wat het beste presteert
bij een temperatuur van 37 graden (daarom in stoof van 37 graden). Cellen loskrijgen van de
bodem van het flesje door er tegenaan te tikken. Je kan dan macroscopisch zien dat je
cellen loskomen van de bodem. Dan de cellen bekijken met het omkeermicroscoop. Alle
cellen moeten los zijn van elkaar en van de bodem. Als de cellen los zijn van elkaar moet de
trypsine weer geremd worden. Dit omdat trypsine de membraan van de cellen kan
beschadigen als het te lang kan inwerken op je cellen. Vervolgens weer kweekmedium
toevoegen. Dit moet je over de bodem van de fles doen omdat daar nog cellen aan kunnen
vastzitten. Je moet dan zorgen dat er een homegenen suspensie ontstaat, dus je gaat met je
pipet de oplossing re suspenderen (op en neer pipetteren). Snel op en neer pipetteren,
anders krijg je geen homegenen suspensie. Cellen overbrengen naar een 15 milliliter buis.
Dit doe je om te voorkomen dat de cellen opnieuw gaan hechten aan de kweekfles. Een klein
deel van de suspensie overbrengen naar een niet-steriel epje. Dit epje gebruik je om de
concentratie van je cel suspensie te bepalen. Eén deel van je cel suspensie mengen met
één deel trypaanblauw. Deze kleurstof kleurt alleen dode cellen (voorzichtig want
trypaanblauw is schadelijk voor je gezondheid). Afval hiervan in speciale container.
Vervolgens onder de telkamer alle ongekleurde cellen tellen. Vervolgens concentratie cellen
berekenen. Dan nieuwe kweekfles labelen (passage nummer verhogen met 1).
Aantekeningen van de eerste celkweek les. Hechtende cellen hechten op de bodem
(bijvoorbeeld macrofagen). Epitheel is de bedek laag van het lichaam. Vandaar dat dit soort
cellen zich hechten aan de bodem (deze moet je dus loskrijgen van de bodem). Suspensie
cellen zitten in een suspensie.
Als de kleur van het medium oranje is geworden wil dat zeggen dat er zich veel cellen in het
medium bevinden (hierdoor zuurder milieu). Als de kleur wat paarser is dan bevinden er zich
minder cellen in het medium (basisch milieu). In je labjournaal moet je bijhouden hoe alle
cellen eruit zien. Je houdt voor drie cellijnen een labjournaal bij. Op de fles zet je je initialen,
je naam, je klas en het passage nummer. Nu is het passage nummer P3, als de cellen zijn
doorgezet is het passage nummer P4.
Aantekeningen lesweek 2
Doorzetten van hechtende cellen. Het nadeel van hechtende cellen is dat ze vastzitten.
Trypsine is een serineprotease en zorgt ervoor dat de adhesiemoleculen verbroken worden.
Niet te lang doen, want anders gaan de cellen kapot. Uiteindelijk moet je dus ook weer
zorgen dat de trypsine geremd wordt. Zie afbeelding voor het proces. In medium zitten de
trypsine remmers.
Aantekeningen lesweek 1
Tijdens celkweek gaan we door met de dierlijke celkweek. Cellen passeren/doorzetten (dit
betekent dat je de cellen van één flesje doorzet naar de andere met verdunningen).
Belangrijk bij celkweek is dat de cellen worden onderhouden in een steriele omgeving (een
besmetting heeft ongewenste invloed op je cellen). We werken in een downflow. Belangrijk is
nauwkeurig, netjes en steriel werken omdat de grootste besmetting je zelf bent (gisten van
brood aan de handen, cellen op de handen, etc.). Afval dierlijke cellen is biohazard afval
(bijzetten bij voorbereiding). Ook gevaarlijke stoffen opzoeken. Van te voren berekenen 50 ml
celcultuur.
Hechtende cellen. Monolayer is een één lagige cel. Als cellen tegen elkaar aankomen dan
stoppen ze met groeien. Ze groeien dus maximaal over de oppervlak van het flesje. Cellen
groeien (hetzelfde als bij bacteriën). Lag fase, log fase, stationaire fase en de dode fase. We
willen alleen in de log fase de cellen bewaren (in de exponentiële fase). Daarom twee keer
per week de cellen doorzetten. Als ze al in de stationaire fase zijn dan is het heel moeilijk om
ze terug te krijgen naar de logfase. Het is van belang om de cellen door te zetten voordat ze
de 100 procent confluentie (als ze helemaal dicht tegen elkaar aanliggen). Bij 100%
confluentie heb je al te maken met de stationaire fase en daarna afstervingsfase. Dus bij
80% al doorzetten!
We kweken cellen in de 6-wellsplaten of in de flessen. Rode spul in 6-wellsplaten is het
medium (rood is de pH indicator, geeft aan dat het de goede pH heeft (meestal ligt die pH
rond de 7). Dierlijke cellen zijn veel gevoeliger voor pH verandering dan bacteriële cellen.
T25, T75 en T175 staat voor de oppervlakte (in vierkante cm). Oppervlakte is belangrijk voor
de groei. Hoe meer cellen hoe een groter oppervlak je gebruikt. Verder worden plastic
pipetten gebruikt. Deze dienen steriel gehouden te worden (niet aanraken met de handen).
Filmpje is heel belangrijk voor thematoets. Functies die worden verteld moet je kennen.
Aandachtspunten filmpje. Vloeistoffen dienen te worden toegevoegd bij 37 graden. Spullen
moet worden gedesinfecteerd met 70% ethanol. Het is van belang dat je een overzichtelijk
ingedeelde werkruimte hebt, bij voorkeur in het midden van de flowkast. Cellen van tevoren
onder de microscoop controleren (labjournaal).
Passeren/doorzetten van cellen. Een volle laag van cellen = monolayer of 100% confluentie.
De exponentiële groeifase vóór 100% confluentie; bij 100% confluentie heb je de stationaire
fase en daarna de afstervingsfase.
Medium. MEM en DMEM worden veel gebruikt. Maar ook IMDM en RPMI. Noteren in je
labjournaal welk medium je gebruikt. Er zijn veel aanpassingen voor verschillende celtypes.
- Aminozuren, vitamines, inorganische zouten, glucose (bron van energie).
- Vaak wordt serum toegevoegd, bijvoorbeeld van een foetaal kalf (bron van groeifactoren,
hormonen, mineralen en lipiden).
- Antibiotica, glutamine, hormone en groeifactoren.
- Serum-vrij medium, geconditioneerd medium.
- pH indicatoren (paars is hij basisch, geel is hij zuur).
→ Besmettingen. Bronnen van besmetting zijn, incubator, waterbad, materialen en
aseptische technieken. Detectie, ze kunnen zowel microscopisch als macroscopisch getest
worden.
* Bacteriën. Hierbij kan een plotselinge pH wisseling plaatsvinden (medium geel). Onder de
microscoop zie je dode cellen (rond en drijvend). Macroscopisch zie je kleine korrels
(coccen/staafjes in de fles).
* Mycoplasma. Dit is een zeer kleine bacterie (0,1 micrometer) en heeft geen celwand.
Mycoplasma is slecht te ontdekken, maar schadelijk voor cellijn/experiment. Er is dan
slechte groei aanwezig. Cellijnen dienen regelmatig getest te worden op mycoplasma
infecties.
* Gisten. Bij gisten is er geen pH verandering. Het medium blijft roze/rood. Wel is er een
, melkachtige neerslag in de kweekfles en hij is troebel. Onder de microscoop zijn ronde of
ovale deeltjes, kleiner dan cellen te zien.
* Schimmels. Ook hierbij treedt geen pH verandering op. Wel is er een slecht groeiende
cellijn. Onder de microscoop zijn kluwen van schimmeldraden te zien.
Flow cytometrie. Analyseert stroom (flow) van cellen (cyto) in druppels. Door lasers te richten
op de stroom. De uitleg/principe hiervan zal worden gedaan tijdens de immunologie les. De
uitleg van de data-analyse zal plaatsvinden tijdens de data-analyse les (programma op usb
zetten).
Flowcytometrie experiment. Hierbij test je op je cellen CD4+ of CD8+ zijn (fluorscent
gelabelde antilichamen tegen CD4 en CD8). Zoek op internet op wat DO11.10 cellen zijn en
verwerk dat in de hypothese.
Aantekeningen filmpje celkweek.
Trypsine niet in het waterbad plaatsen. Met behulp van het enzym trypsine worden de cellen
van elkaar en van de kweekfles losgeknipt. Het medium dat bij de cellen zit bevat FCS, wat
de werking van trypsine verminderd. Daarom worden de cellen eerst met PBS gewassen om
het oude kweekmedium met de FCS te verwijderen. Ook worden op deze manier dode cellen
die ronddrijven in het medium weggewassen. Trypsine is een enzym wat het beste presteert
bij een temperatuur van 37 graden (daarom in stoof van 37 graden). Cellen loskrijgen van de
bodem van het flesje door er tegenaan te tikken. Je kan dan macroscopisch zien dat je
cellen loskomen van de bodem. Dan de cellen bekijken met het omkeermicroscoop. Alle
cellen moeten los zijn van elkaar en van de bodem. Als de cellen los zijn van elkaar moet de
trypsine weer geremd worden. Dit omdat trypsine de membraan van de cellen kan
beschadigen als het te lang kan inwerken op je cellen. Vervolgens weer kweekmedium
toevoegen. Dit moet je over de bodem van de fles doen omdat daar nog cellen aan kunnen
vastzitten. Je moet dan zorgen dat er een homegenen suspensie ontstaat, dus je gaat met je
pipet de oplossing re suspenderen (op en neer pipetteren). Snel op en neer pipetteren,
anders krijg je geen homegenen suspensie. Cellen overbrengen naar een 15 milliliter buis.
Dit doe je om te voorkomen dat de cellen opnieuw gaan hechten aan de kweekfles. Een klein
deel van de suspensie overbrengen naar een niet-steriel epje. Dit epje gebruik je om de
concentratie van je cel suspensie te bepalen. Eén deel van je cel suspensie mengen met
één deel trypaanblauw. Deze kleurstof kleurt alleen dode cellen (voorzichtig want
trypaanblauw is schadelijk voor je gezondheid). Afval hiervan in speciale container.
Vervolgens onder de telkamer alle ongekleurde cellen tellen. Vervolgens concentratie cellen
berekenen. Dan nieuwe kweekfles labelen (passage nummer verhogen met 1).
Aantekeningen van de eerste celkweek les. Hechtende cellen hechten op de bodem
(bijvoorbeeld macrofagen). Epitheel is de bedek laag van het lichaam. Vandaar dat dit soort
cellen zich hechten aan de bodem (deze moet je dus loskrijgen van de bodem). Suspensie
cellen zitten in een suspensie.
Als de kleur van het medium oranje is geworden wil dat zeggen dat er zich veel cellen in het
medium bevinden (hierdoor zuurder milieu). Als de kleur wat paarser is dan bevinden er zich
minder cellen in het medium (basisch milieu). In je labjournaal moet je bijhouden hoe alle
cellen eruit zien. Je houdt voor drie cellijnen een labjournaal bij. Op de fles zet je je initialen,
je naam, je klas en het passage nummer. Nu is het passage nummer P3, als de cellen zijn
doorgezet is het passage nummer P4.
Aantekeningen lesweek 2
Doorzetten van hechtende cellen. Het nadeel van hechtende cellen is dat ze vastzitten.
Trypsine is een serineprotease en zorgt ervoor dat de adhesiemoleculen verbroken worden.
Niet te lang doen, want anders gaan de cellen kapot. Uiteindelijk moet je dus ook weer
zorgen dat de trypsine geremd wordt. Zie afbeelding voor het proces. In medium zitten de
trypsine remmers.
