OPLOSSING VRAGEN
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
(TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken
weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Soort Conventionele lichtmicroscopie TEM
Resolutie 0,1 nm(virus, DNA, glucose en
0,2 μm(haar, bloedcel en atoom) à ultrastructuren,
bacterie)àcellulaire structuur intracellulaire structuren
Voorbewerking 1. Bewaren en fixeren weefsel; Zeer dunne coupes (~1μm,
micrometer) moeten gemaakt
2. Vervaardigen weefselsneden worden. Hiervoor worden
(coupes); fixeerde weefsels ingebed in
hard materiaal, doorgaans
3. Kleuren weefselsneden. epoxyhars. Door hardheid
dienen coupes gesneden te
worden met een diamantmes
of glasmes.
, Reden Weefsel wordt zo bewaard dat er Het geringste weefselverval
geen chemische/structurele gaat dan ook zichtbaar zijn, en
verandering is. Hiervoor worden het te onderzoeken weefsel
afbraakprocessen, door intrinsieke minder goed beoordeelbaar
en externe factoren, zoveel maken. Al enkele minuten
mogelijk afgeremd/voorkomen en nadat cellen gescheiden raken
moet de macromoleculaire van hun bloedvoorziening
structuur zo intact mogelijk treedt er osmotisch zwelling
gehouden worden. op van mitochondria en
Afbraakprocessen komen op gang endoplasmatisch reticulum.
door gebrek aan aanvoer zuurstof, Een goede en snelle fixatie zijn
gebrek aan afvoer dan ook cruciaal.
afbraakproducten en door
vrijkomen van verteringsenzymen.
O.a. aan lytische enzymen,
aanwezig in peroxisomen. Weefsel
wordt ook vernietigd door
verteringsenzymen vrijgezet door
micro-organismen die van buiten
het weefsel infecteren.
Verteringsprocessen worden
afgeremd door weefsel fixeren of
invriezen waardoor ook groei van
micro-organismen uitgeschakeld
wordt. Keuze van fixeren of
invriezen wordt bepaald door de
aard van het weefsel en is
afhankelijk van de methoden die
nodig zijn voor het uit te voeren
onderzoek.
2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Lichtmicroscoop: Verteringsprocessen worden afgeremd waardoor ook groei van micro-
organismen stopt. Weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator). Hierdoor
worden covalente bindingen gevormd met N-terminale groepen van eiwitten, volgens
“crosslinking”. Eiwitten worden zo aan cytoskelet en hun interagerende eiwitten
vastgehecht. Meeste enzymen verliezen hun enzymatische werking. Duur varieert van 2h tot
24h, afhankelijk van grootte materiaal, en gebruikte methode van fixatie en fixator.
Hoeveelheid fixator minimaal 5x het volume van weefsel. Formol= waterige oplossing op
basis van formaldehyde, meest gebruikte fixator.
,Elektronenmicroscoop: Goede en snelle fixatie cruciaal. Kwaliteit afhankelijk van grootte
weefselfragment gebruikte fixator. Fragmenten maximum 1-2 mm groot. In gekoelde (4°C)
glutaaraldehyde. Gevolgd door 2e fixatie in osmiumtetroxide (OsO4) om vetten te bewaren
(o.a. door oxidatie van onverzadigde vetten). Laatste reactie voegt extra ‘gewicht’ toe aan
welbepaalde locaties weefsel zodat deze beter zichtbaar is in een elektronenmicroscoop.
3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en
immunofluorescentie.
Immunohistochemie immunofluorescentie
Verschillen Enzymatische reactie zorgt Antigen wordt gedetecteerd waarbij
voor detectie. primaire antistof wordt gekoppeld aan
fluorofoor, die na beschijnen met licht van
juiste golflengte fluorescent licht zal
uitstralen. Voordeel is dat gemakkelijk
verschillende antigenen op een zelfde slide
kunnen worden gevisualiseerd, door
verschillende fluoroforen die verschillende
kleuren licht uitzenden te gebruiken.
Gelijkenissen Eenvoudige 1 of 2 stap
techniek. Idem.
Ze werken beide doordat
een antistof, gebonden aan
een molecule die zorgt voor
, detectie, bindt met een
antigen in het weefsel.
Immunohistochemie is een breed begrip.
Immunohistochemische kleuringen berusten op de specifieke binding van antistoffen (syn.
antilichamen) aan antigenen. Antigenen zijn lichaamsvreemde (of –eigen) stoffen waartegen
antistoffen kunnen gevormd worden. Het gaat hier om het geheel van eiwitten,
glycoproteïnen, enz. aanwezig extracellulair of ter hoogte van membranen, cytoplasma of
kern. Antistoffen zijn afweerproducten aangemaakt door het immunologisch afweersysteem
van de gastheer. Antistoffen binden specifiek met het antigeen waar ze tegen gericht zijn.
Wanneer een bepaald antigeen in de weefselcoupe aanwezig is, zal een hiertegen gerichte
antistof een immuuncomplex vormen ter hoogte van dit antigeen. Deze immuuncomplexen
zijn als dusdanig niet zichtbaar. Om de reactie zichtbaar te maken wordt de antistof
gebonden aan een fluorescerende molecule, enzym, biotine of goudpartikel.
immunofluorescentie is dus het zichtbaar maken van de reactie via een fluorescerend
molecule.
4. Bespreek directe, indirecte en ge-ampificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
• Directe methode: het antistof gebruikt om een bepaald antigeen op te sporen is zelf
gelabeld. Deze techniek is snel, eenvoudig maar geeft weinig signaalversterking en
lage hoeveelheden antigeen worden veel moeilijker gedetecteerd. Deze methode
wordt voornamelijk gebruikt om immuunglobuline en complementdeposities op te
sporen in huid- en nierbiopten. Het beste resultaat wordt bekomen in vriescoupes en
als label wordt dan meestal ook een fluoresceïne gebruikt.
• Indirecte methode: Het specifieke antilichaam dat men wil gebruiken is niet gelabeld.
Dit is het primaire antilichaam. Na incubatie van dit primaire antilichaam wordt op de
coupe een tweede (secundair) antilichaam aangebracht. Dit is wel gelabeld en is een
algemeen antilichaam gericht tegen immuunglobulines van dezelfde diersoort als
waarin het primaire antilichaam werd opgewekt.
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
(TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken
weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Soort Conventionele lichtmicroscopie TEM
Resolutie 0,1 nm(virus, DNA, glucose en
0,2 μm(haar, bloedcel en atoom) à ultrastructuren,
bacterie)àcellulaire structuur intracellulaire structuren
Voorbewerking 1. Bewaren en fixeren weefsel; Zeer dunne coupes (~1μm,
micrometer) moeten gemaakt
2. Vervaardigen weefselsneden worden. Hiervoor worden
(coupes); fixeerde weefsels ingebed in
hard materiaal, doorgaans
3. Kleuren weefselsneden. epoxyhars. Door hardheid
dienen coupes gesneden te
worden met een diamantmes
of glasmes.
, Reden Weefsel wordt zo bewaard dat er Het geringste weefselverval
geen chemische/structurele gaat dan ook zichtbaar zijn, en
verandering is. Hiervoor worden het te onderzoeken weefsel
afbraakprocessen, door intrinsieke minder goed beoordeelbaar
en externe factoren, zoveel maken. Al enkele minuten
mogelijk afgeremd/voorkomen en nadat cellen gescheiden raken
moet de macromoleculaire van hun bloedvoorziening
structuur zo intact mogelijk treedt er osmotisch zwelling
gehouden worden. op van mitochondria en
Afbraakprocessen komen op gang endoplasmatisch reticulum.
door gebrek aan aanvoer zuurstof, Een goede en snelle fixatie zijn
gebrek aan afvoer dan ook cruciaal.
afbraakproducten en door
vrijkomen van verteringsenzymen.
O.a. aan lytische enzymen,
aanwezig in peroxisomen. Weefsel
wordt ook vernietigd door
verteringsenzymen vrijgezet door
micro-organismen die van buiten
het weefsel infecteren.
Verteringsprocessen worden
afgeremd door weefsel fixeren of
invriezen waardoor ook groei van
micro-organismen uitgeschakeld
wordt. Keuze van fixeren of
invriezen wordt bepaald door de
aard van het weefsel en is
afhankelijk van de methoden die
nodig zijn voor het uit te voeren
onderzoek.
2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Lichtmicroscoop: Verteringsprocessen worden afgeremd waardoor ook groei van micro-
organismen stopt. Weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator). Hierdoor
worden covalente bindingen gevormd met N-terminale groepen van eiwitten, volgens
“crosslinking”. Eiwitten worden zo aan cytoskelet en hun interagerende eiwitten
vastgehecht. Meeste enzymen verliezen hun enzymatische werking. Duur varieert van 2h tot
24h, afhankelijk van grootte materiaal, en gebruikte methode van fixatie en fixator.
Hoeveelheid fixator minimaal 5x het volume van weefsel. Formol= waterige oplossing op
basis van formaldehyde, meest gebruikte fixator.
,Elektronenmicroscoop: Goede en snelle fixatie cruciaal. Kwaliteit afhankelijk van grootte
weefselfragment gebruikte fixator. Fragmenten maximum 1-2 mm groot. In gekoelde (4°C)
glutaaraldehyde. Gevolgd door 2e fixatie in osmiumtetroxide (OsO4) om vetten te bewaren
(o.a. door oxidatie van onverzadigde vetten). Laatste reactie voegt extra ‘gewicht’ toe aan
welbepaalde locaties weefsel zodat deze beter zichtbaar is in een elektronenmicroscoop.
3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en
immunofluorescentie.
Immunohistochemie immunofluorescentie
Verschillen Enzymatische reactie zorgt Antigen wordt gedetecteerd waarbij
voor detectie. primaire antistof wordt gekoppeld aan
fluorofoor, die na beschijnen met licht van
juiste golflengte fluorescent licht zal
uitstralen. Voordeel is dat gemakkelijk
verschillende antigenen op een zelfde slide
kunnen worden gevisualiseerd, door
verschillende fluoroforen die verschillende
kleuren licht uitzenden te gebruiken.
Gelijkenissen Eenvoudige 1 of 2 stap
techniek. Idem.
Ze werken beide doordat
een antistof, gebonden aan
een molecule die zorgt voor
, detectie, bindt met een
antigen in het weefsel.
Immunohistochemie is een breed begrip.
Immunohistochemische kleuringen berusten op de specifieke binding van antistoffen (syn.
antilichamen) aan antigenen. Antigenen zijn lichaamsvreemde (of –eigen) stoffen waartegen
antistoffen kunnen gevormd worden. Het gaat hier om het geheel van eiwitten,
glycoproteïnen, enz. aanwezig extracellulair of ter hoogte van membranen, cytoplasma of
kern. Antistoffen zijn afweerproducten aangemaakt door het immunologisch afweersysteem
van de gastheer. Antistoffen binden specifiek met het antigeen waar ze tegen gericht zijn.
Wanneer een bepaald antigeen in de weefselcoupe aanwezig is, zal een hiertegen gerichte
antistof een immuuncomplex vormen ter hoogte van dit antigeen. Deze immuuncomplexen
zijn als dusdanig niet zichtbaar. Om de reactie zichtbaar te maken wordt de antistof
gebonden aan een fluorescerende molecule, enzym, biotine of goudpartikel.
immunofluorescentie is dus het zichtbaar maken van de reactie via een fluorescerend
molecule.
4. Bespreek directe, indirecte en ge-ampificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
• Directe methode: het antistof gebruikt om een bepaald antigeen op te sporen is zelf
gelabeld. Deze techniek is snel, eenvoudig maar geeft weinig signaalversterking en
lage hoeveelheden antigeen worden veel moeilijker gedetecteerd. Deze methode
wordt voornamelijk gebruikt om immuunglobuline en complementdeposities op te
sporen in huid- en nierbiopten. Het beste resultaat wordt bekomen in vriescoupes en
als label wordt dan meestal ook een fluoresceïne gebruikt.
• Indirecte methode: Het specifieke antilichaam dat men wil gebruiken is niet gelabeld.
Dit is het primaire antilichaam. Na incubatie van dit primaire antilichaam wordt op de
coupe een tweede (secundair) antilichaam aangebracht. Dit is wel gelabeld en is een
algemeen antilichaam gericht tegen immuunglobulines van dezelfde diersoort als
waarin het primaire antilichaam werd opgewekt.
