Samenvatting methoden in biomedisch onderzoek 3

Methoden
3.2. DNA
3.2.1 DNA sequentiebepaling
Evolutie in methoden
First-generation sequencing (1977)

 Sanger, (Maxam and Gilbert)
 cloneren (plasmiden - bacteriën)
 elektroforese
 nog steeds “gouden standaard”, voor kleine projecten

Second-generation sequencing

 ‘next-generation sequencing’ (2006-…)
 massief parallel sequencen van clonaal in vitro
 geamplificeerde DNA moleculen
 bv. Illumina, Ion Torrent

Third-generation sequencing

 “next-next generation sequencing” (2010-…)
 sequencing van individuele DNA moleculen
 (geen amplificatie)
 bv. Nanopore, Pacific Biosciences

Brede toepassingen
De novo genoom sequentiebepaling

 ongekende genomen-> voor eerste keer sequencen
 bv Humaan Genoom project
 nieuwe organismen (bv. Sars-CoV-2)
 gedeeltelijk of volledig

Resequencing

 individuen tov referentiegenoom
 verschillen tussen individuen (SNPs)
 mutaties (ziekten)
 Construct verificatie
 klinische toepassingen:
diagnose, farmacogenetica, NIPT
 (niet invasieve prenatale test), …

Sequentiebepaling als teller

,  aantallen DNA (of RNA) moleculen
 (zie RNAseq, ChIPseq,…)

3.2.1.1 1ste generatie sequentiebepaling
Twee methoden: Maxam en Gilbert / Sanger (1977, Nobel prijs 1980)

Maxam en Gilbert = chemische klieving methode (historisch, ter
illustratie)

 Fosfaat groep vervangen door radioactieve fosfaat
 1 van de 2 labels verwijderen met restrictie enzymen
 differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4
verschillende reacties, gevolgd door scheiding volgens grootte op
gel en visualisatie via autoradiografie->-> bv 1 ste buisje->
breken na de eerste G, bij de tweede na een A of een G

 nadeel: relatief korte fragmenten, niet helemaal specifiek 
sequentie niet altijd éénduidig

Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie

 template/matrijs = clone of PCR amplicon bv van genomisch DNA-fragment
 polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs(Normale dNTP: 2’OH groep ontbreekt,
bij ddNTP: ook 3’ OH groep ontbreekt, dat is de OH groep die fosfodiesterverbindingen gaat
vormen in een DNA keten
 reactie loopt door na inbouwen dNTP
 reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP
 juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
 scheiding strengen op gel of capillair -> elektroferogram-> Capillaire gelektroforese: kleine
fragmentjes (paars) komen eerst voorbij de sensor en worden eerst afgelezen, langste
fragmentjes laatst, dus van links naar rechts is van klein naar groot.
 beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen
 voor betrouwbaarheid: best twee aparte reacties
(FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen

Elektroferogram aflezen

 1ste 30 bp niet afleesbaar
 meestal 500-700 bp (max. tot 1000 bp) goede
sequentie afleesbaar

Phred score Q = -10*log10(P)

P = probabiliteit van foutieve base cal

-> Score van 10-> 1 op de 10 basen zijn fout

Minimaal een score van 20 voor een goede maar liefst 30

,Mutatiedetectie
Sanger sequencing gebruikt voor mutatiedetectie

 Niet altijd even hoge pieken
 sequentie-fout versus mutatie? -> forward en reverse
reacties ter bevestiging



3.2.1.2. 2de generatie sequentiebepaling: short-read next-
generation sequencing

 doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost  massale DNA sequentiebepaling mogelijk
 richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor <1000 USD (“thousand-dollar
genome”)

Ontwikkeling van nieuwe technologie met 3 pijlers:

parallelle detectie (Massive parallel sequencing)

 cluster of polony = kopieën van een DNA template
 klonale in vitro amplificatie van template (<> klassieke klonering)
 duizenden-miljoenen kopieën van DNA template per cluster
 multiplexing: vele clusters tegelijk (<> 1 template/reactie)

miniaturisatie van reacties

integratie van het proces (pipeline)

 directe detectie (<> scheiding fragmenten via gelelectroforese)



Verschillende commerciële platformen

 454/Roche, Illumina, SOLID, Ion Torrent,..
 Zeer competitief
 Snelle evolutie



Gebaseerd op 4 stappen:

Stap1. Aanmaak DNA library

Stap 2. Klonale in vitro amplificatie

Stap 3. Sequencing/sequentiebepaling

Stap 4. Data analyse

, Stap 1: aanmaak NGS(: next generation sequencing) DNA library

library = fragmentenbank = verzameling te sequencen templates

types DNA library:

 whole genome sequencing (WGS)
 Mate Pair libraries (zie verder)
 whole exome sequencing (WES) of targeted sequencing:
aanrijking door hybridisatie aan probes (in oplossing of op array) (zie panel A) of PCR-
gebaseerd (zie panel B)
 amplicon sequencing: PCR amplicons, bv. diagnostisch panel
 cDNA library (RNA-seq – Zie Hfst RNA)


A:

 Alle exons als oligos hybridiseren op het
plaatje, introns worden weg gewassen
 Kan ook met beads gedaan worden

B:

 PCR amplicons maken: PCR primers
maken tegen alle exons sequentie en
dan amplificeren we de exons

-> kan bij mondeling examen komen: hoe exon
sequentie doen?

Procedure voor aanmaak library:

input DNA -> kwaliteitscontrole (zie Hfdst 1.13)

 hoeveelheid en concentratie: verschillende methoden
 zuiverheid, bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230
ratio
 integriteit, bv capillaire elektroforese

random fragmentatie (sonicatie, nebulisatie, Dnase I,…)

 vinden we altijd een overlap

end repair (zie ook Hfdst 1.13)

 blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow
fragment)
 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase)
 eventueel 3’ non-template A aanhechten (Taq
polymerase)




adapters aanhechten: