BIOTECHNOLOGIE = het gebruik & manipulatie van biologische systemen ter (industriële)
bereiding van natuurlijk grondstoffen en biomassa (micro-organismen, bacteriën, gisten,
plantencellen, dierlijke cellen) die van belang zijn voor de mens.
=> niét traditionele agricultuur & veeteelt
Tijdperk 1: onbewust gebruik van bacteriën & gisten
Ter productie van levensmiddelen als bier, wijn, kaas, yoghurt & azijn.
Onbewust tot Pasteur ontdekte dat micro-organismen verantwoordelijk zijn voor bepaalde
omzettingen (productie van alcohol uit suikers, verzuring van wijn)
Op die manier kon bewust gebruikt worden gemaakt van biologische systemen, alhoewel de
techniek om contaminaties met vreemde micro-organismen uit te sluiten nog niet gekend
was
Tijdperk 2: de introductie van industriële processen om grote hoeveelheden glycol, butanol,
aceton, en citroenzuur aan te maken (massaproductie opgestart van bakkersgist). Al deze
processen werden niet gehinderd door vreemde micro-organismen
Tijdperk 3: wel zuivere culturen door kennis van aseptische technieken -> farmaceutische
productie van penicillines
Tijdperk 4: invoer van recombinant DNA-technieken en de definitieve doorbraak van
plantaardige & dierlijke celculturen in productieprocessen
Biotechnologie is veel meer dan enkel de DNA manipulaties, alhoewel beide begrippen vaak
verkeerdelijk als synoniemen gebruikt worden
Biogene geneesmiddelen: van natuurlijke oorsprong
Synthetische & anorganische gm: mbv chemie bekomen
Primaire metabolieten: stoffen die van nature belangrijk
zijn voor het in stand houden v/h organisme (lipiden,
suikers, eiwitten)
Secundaire metabolieten: vooral door plantcellen &
micro-organismen geproduceerd (ook de antibioticas zijn
secondaire metabolieten)
We gaan het hebben over de aanmaak van eiwitten als
een mogelijk geneesmiddel in rest cursus
Eiwitten: 2 grote groepen biotech geneesmiddelen
- recombinante eiwitten: eiwitten (meestal van menselijke oorsprong) dat
aangemaakt wordt door genetische manipulatie in een bepaald organisme (bacterie,
gist, plantcel, diercel) in zo groot mogelijke hoeveelheden
- therapeutische antilichamen: aangemaakt (vaak recombinant) en dan als
geneesmiddel verkocht
We hebben het in deze cursus enkel over recombinante eiwitten.
> 160 biotechgeneesmiddelen op Belgische markt, is ongeveer 1/5e van de totale
geneesmiddelen in apotheek en helft van de geneesmiddelen in ontwikkeling zijn
biotechgeneesmiddelen (vooral gericht tegen kanker & infectieziekten)
,Bv: insuline tegen diabetes, erytropoëtine (EPO) tegen bloedarmoede,
granulietkoloniestimulerende factor (GCSF) bij ondersteuning van menselijk immuunsysteem
na chemotherapie, ..
Niet alleen eiwitten maar ook vaccins worden ook ontwikkeld mbh biotechnologie
Allereerste vaccin op Belgische markt: hepatitis B
BIOTECHNOLOGIE: GENETISCH ONGEWIJZIGDE MICRO-ORGANISMEN
Aanmaak van biotechgeneesmiddelen (eiwitten) vertrekkende van organismen die NIET
genetisch gemanipuleerd zijn:
Mbv FERMENTATIE = productie van biomassa door micro-organismen
Je vult een reactietank (fermentor) met een vloeibaar voedingsmedium, je doet je micro-
organisme erbij en je start je cultuur op (je fermentatie).
Voedingsmedium: meestal minimaal medium gebruiken = milieu dat enkel bestaat uit:
- C-bron zoals glucose voor de aanmaak van ATP
- N-bron voor aanmaak van aminozuren
- zouten en sporenelementen
Waarom geen rijk medium? Bevat veel meer voedingsstoffen dus micro-organismen groeien
misschien beter & sneller?
Goedkoper
Makkelijker eiwit uit medium te zuiveren
3 verschillende processen van fermentatie:
- batch proces: eenvoudigste
● fermentor vullen met voedingsmedium
● vat gevuld: organisme bijdoen
● fermentatie starten (opkweken) tot bepaald punt wordt bereikt: bepaalde
celdensiteit of bepaalde concentratie van eindproduct
● fermentorvat ledigen, product oogsten & opzuiveren
- continu proces:
● reactorvat vullen
● organisme bijdoen
● fermentatie starten: tijdens fermentatie continu vers voedingsmedium
toevoegen
● ondertussen medium met micro-organismen (reactiemengsel) afvoeren
= continu proces waardoor men langere tijd organismen in kweek houden & product oogsten
- continu proces met celrecyclering: handig wanneer organismen slecht te kweken
zijn, slecht groeien, traag groeien
= recycleren van verwijderde micro-organismen
● reactorvat vullen
● organisme bijdoen
● fermentatie starten
● continu vers voedingsmedium toevoegen
● reactiemengsel met cellen afvoeren
● cellen die je afvoert worden gerecycleerd = scheiden van reactiemengsel &
terug in reactorvat brengen
Gebruikte micro-organismen:
Meestal organismen die een GRAS-status hebben: generally recognized as safe
,= niet pathogeen, niet toxisch, kunnen meestal geen antibiotica produceren
= veilige productie van het gewenst eindproduct
- bacteriën: Bacillus, Streptomyces
- schimmels: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus
- gisten: Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist)
Eindproducten: enzymen, eenvoudige organische chemicaliën, geur-en smaakstoffen,
polysachariden, antibiotica, kleurstoffen, aminozuren enz
RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE
Aanmaak van biotechgeneesmiddelen (eiwitten) vertrekkende van organismen die WEL
genetisch gemanipuleerd zijn:
Inleiding: DNA/RNA
DNA/RNA: opgebouwd uit 4 verschillende nucleotiden (G C A T/U)
Elk nucleotide is opgebouwd uit een pentose-suiker (5-C suikermolecule): op diens 1-positie
staat een N-houdende heterocyclische base en op diens 5-positie een fosfaatgroep.
-> 5 basen: purines adenine & guanine, en pyrimidines uracil, thymine en cytosine
In RNA uracil ipv thymine
In RNA ribose ipv deoxyribose:
Nucleotide: P-groep
Nucleoside: geen P-groep
Primaire DNA-structuur = een polynucleotide structuur doordat een 3’5’ fosfodiesterbinding
ontstaat tussen 5’-P van het ene nucleotide en het 3’-OH van het volgende nucleotide
= suiker-fosfaatskelet waarop de basen gebonden zijn via de C-1’ van de suikermolecule.
Secundaire DNA-structuur (Watson & Crick model: dubbelstrengig)
- 2 anti-parallelle ketens: de ene streng 5’->3’, de andere 3’->5’, blijven aaneen door
H-bruggen tussen de basen (A-T = 2 H-bruggen, C-G = 3 H-bruggen -> GC-rijke
DNA-structuur is dus steviger aaneen gekoppeld)
- dubbelstrengig, de baseparen liggen in 1 vlak loodrecht op de lengterichting
- rechtsdraaiende helixstructuur, stabiliteit dankzij VDW- en hydrofobe interacties
Transcriptie = omzetting van DNA -> mRNA om eiwitten te kunnen vormen
(Translatie = RNA -> eiwit)
Zeer selectief: slechts 1% van het DNA wordt omgezet in mRNA adhv RNA polymerase
(bij zoogdiercellen)
, RNA polymerase = DNA-afhankelijk, vormt een RNA-keten: bindt op een promoter en
synthetiseert een RNA-streng van 5’->3’ tot aan een stopsignaal.
3 RNA polymerasen in eukaryoten:
- RNA polymerase I: maakt rRNA aan
- RNA polymerase II voor transcriptie: DNA -> mRNA: schrijft genen over die vertaald
zullen worden in eiwitten
- RNA polymerase III: maakt oa tRNA aan
mRNA wordt aan 5’ en 3’-uiteinden gemodificeerd om ze te kunnen onderscheiden van de
RNA’s aangemaakt door de andere RNA polymerasen & zo aan te geven dat ze omgezet
moeten worden naar eiwitten
- 5’ cap: aan 5’-uiteinde mRNA wordt vrijwel onmiddellijk een capstructuur gezet door
toevoeging van een gemethyleerd Guanosine (= een 5’-5’ binding!)
deze 5’-cap is belangrijk voor de eiwitsynthese en beschermt RNA tegen degradatie
- 3’ poly A staart: polyadenylatie van mRNA aan 3’-uiteinde:
RNA-polymerase schuift over dubbelstrengig DNA en gaat ondertussen een RNA-
keten vormen die ook een 5’ cap-structuur draagt
RNA-polymerase gaat een polyadenylatiesignaal overschrijven (AAUAAA) dat
herkend wordt door eiwitten die op dat RNA gaan binden waardoor transcriptie stopt
& het mRNA-transcript hier gekliefd wordt door een endonuclease waardoor het
vrijkomt, waarna een ander enzym (polyA polymerase) er een lange A-keten aanzet
(staart van 252 A-nucleotiden) zodat mRNA aan 3’-uiteinde ook beschermd is tegen
afbraak door nucleasen
Naarmate RNA-polymerase over DNA schuift groeit de RNA-keten aan.
Zonder cap-structuur snel afbraak van RNA waardoor geen mRNA.
====> primaire RNA-transcript: precursor voor het uiteindelijke RNA want mRNA ondergaat
nog splicing: als er introns aanwezig zijn gaan de introns verwijderd worden waardoor enkel
coderende exons overblijven die omgezet kunnen worden naar eiwitstructuur.
RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE
ISOLATIE GENOMISCH DNA
DNA-isolatie mbv commercieel verkrijgbare DNA-isolatiekits
Genetisch gewijzigd organisme maken STAP 1: vertrekken van een beetje DNA dat codeert
voor het menselijke gen dat je wil, binnenbrengen in de bacterie opdat die dat zou kunnen
maken
=> dus eerst DNA isoleren van een menselijk staal om zo het gen te kunnen bekomen uit de
bacterie
-> isolatie cellen waarna je de cellen lyseert in een lyse-oplossing: je breekt de cellen open
opdat DNA vrij kan komen, verschillende manieren:
- geïnteresseerd in bacterieel DNA:
● bacteriën brengen in buffer met lysozyme (= breekt celwand bacterie af ) waarna je
Triton X-100 toevoegt (= detergent die membranen oplost) en nadien nog RNase A
toevoegen (= enzymen die RNA afbreken, want je wil enkel DNA).
Dit mengsel bij 37°, 30min omdat lysozyme dan optimaal werkt
bereiding van natuurlijk grondstoffen en biomassa (micro-organismen, bacteriën, gisten,
plantencellen, dierlijke cellen) die van belang zijn voor de mens.
=> niét traditionele agricultuur & veeteelt
Tijdperk 1: onbewust gebruik van bacteriën & gisten
Ter productie van levensmiddelen als bier, wijn, kaas, yoghurt & azijn.
Onbewust tot Pasteur ontdekte dat micro-organismen verantwoordelijk zijn voor bepaalde
omzettingen (productie van alcohol uit suikers, verzuring van wijn)
Op die manier kon bewust gebruikt worden gemaakt van biologische systemen, alhoewel de
techniek om contaminaties met vreemde micro-organismen uit te sluiten nog niet gekend
was
Tijdperk 2: de introductie van industriële processen om grote hoeveelheden glycol, butanol,
aceton, en citroenzuur aan te maken (massaproductie opgestart van bakkersgist). Al deze
processen werden niet gehinderd door vreemde micro-organismen
Tijdperk 3: wel zuivere culturen door kennis van aseptische technieken -> farmaceutische
productie van penicillines
Tijdperk 4: invoer van recombinant DNA-technieken en de definitieve doorbraak van
plantaardige & dierlijke celculturen in productieprocessen
Biotechnologie is veel meer dan enkel de DNA manipulaties, alhoewel beide begrippen vaak
verkeerdelijk als synoniemen gebruikt worden
Biogene geneesmiddelen: van natuurlijke oorsprong
Synthetische & anorganische gm: mbv chemie bekomen
Primaire metabolieten: stoffen die van nature belangrijk
zijn voor het in stand houden v/h organisme (lipiden,
suikers, eiwitten)
Secundaire metabolieten: vooral door plantcellen &
micro-organismen geproduceerd (ook de antibioticas zijn
secondaire metabolieten)
We gaan het hebben over de aanmaak van eiwitten als
een mogelijk geneesmiddel in rest cursus
Eiwitten: 2 grote groepen biotech geneesmiddelen
- recombinante eiwitten: eiwitten (meestal van menselijke oorsprong) dat
aangemaakt wordt door genetische manipulatie in een bepaald organisme (bacterie,
gist, plantcel, diercel) in zo groot mogelijke hoeveelheden
- therapeutische antilichamen: aangemaakt (vaak recombinant) en dan als
geneesmiddel verkocht
We hebben het in deze cursus enkel over recombinante eiwitten.
> 160 biotechgeneesmiddelen op Belgische markt, is ongeveer 1/5e van de totale
geneesmiddelen in apotheek en helft van de geneesmiddelen in ontwikkeling zijn
biotechgeneesmiddelen (vooral gericht tegen kanker & infectieziekten)
,Bv: insuline tegen diabetes, erytropoëtine (EPO) tegen bloedarmoede,
granulietkoloniestimulerende factor (GCSF) bij ondersteuning van menselijk immuunsysteem
na chemotherapie, ..
Niet alleen eiwitten maar ook vaccins worden ook ontwikkeld mbh biotechnologie
Allereerste vaccin op Belgische markt: hepatitis B
BIOTECHNOLOGIE: GENETISCH ONGEWIJZIGDE MICRO-ORGANISMEN
Aanmaak van biotechgeneesmiddelen (eiwitten) vertrekkende van organismen die NIET
genetisch gemanipuleerd zijn:
Mbv FERMENTATIE = productie van biomassa door micro-organismen
Je vult een reactietank (fermentor) met een vloeibaar voedingsmedium, je doet je micro-
organisme erbij en je start je cultuur op (je fermentatie).
Voedingsmedium: meestal minimaal medium gebruiken = milieu dat enkel bestaat uit:
- C-bron zoals glucose voor de aanmaak van ATP
- N-bron voor aanmaak van aminozuren
- zouten en sporenelementen
Waarom geen rijk medium? Bevat veel meer voedingsstoffen dus micro-organismen groeien
misschien beter & sneller?
Goedkoper
Makkelijker eiwit uit medium te zuiveren
3 verschillende processen van fermentatie:
- batch proces: eenvoudigste
● fermentor vullen met voedingsmedium
● vat gevuld: organisme bijdoen
● fermentatie starten (opkweken) tot bepaald punt wordt bereikt: bepaalde
celdensiteit of bepaalde concentratie van eindproduct
● fermentorvat ledigen, product oogsten & opzuiveren
- continu proces:
● reactorvat vullen
● organisme bijdoen
● fermentatie starten: tijdens fermentatie continu vers voedingsmedium
toevoegen
● ondertussen medium met micro-organismen (reactiemengsel) afvoeren
= continu proces waardoor men langere tijd organismen in kweek houden & product oogsten
- continu proces met celrecyclering: handig wanneer organismen slecht te kweken
zijn, slecht groeien, traag groeien
= recycleren van verwijderde micro-organismen
● reactorvat vullen
● organisme bijdoen
● fermentatie starten
● continu vers voedingsmedium toevoegen
● reactiemengsel met cellen afvoeren
● cellen die je afvoert worden gerecycleerd = scheiden van reactiemengsel &
terug in reactorvat brengen
Gebruikte micro-organismen:
Meestal organismen die een GRAS-status hebben: generally recognized as safe
,= niet pathogeen, niet toxisch, kunnen meestal geen antibiotica produceren
= veilige productie van het gewenst eindproduct
- bacteriën: Bacillus, Streptomyces
- schimmels: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus
- gisten: Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist)
Eindproducten: enzymen, eenvoudige organische chemicaliën, geur-en smaakstoffen,
polysachariden, antibiotica, kleurstoffen, aminozuren enz
RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE
Aanmaak van biotechgeneesmiddelen (eiwitten) vertrekkende van organismen die WEL
genetisch gemanipuleerd zijn:
Inleiding: DNA/RNA
DNA/RNA: opgebouwd uit 4 verschillende nucleotiden (G C A T/U)
Elk nucleotide is opgebouwd uit een pentose-suiker (5-C suikermolecule): op diens 1-positie
staat een N-houdende heterocyclische base en op diens 5-positie een fosfaatgroep.
-> 5 basen: purines adenine & guanine, en pyrimidines uracil, thymine en cytosine
In RNA uracil ipv thymine
In RNA ribose ipv deoxyribose:
Nucleotide: P-groep
Nucleoside: geen P-groep
Primaire DNA-structuur = een polynucleotide structuur doordat een 3’5’ fosfodiesterbinding
ontstaat tussen 5’-P van het ene nucleotide en het 3’-OH van het volgende nucleotide
= suiker-fosfaatskelet waarop de basen gebonden zijn via de C-1’ van de suikermolecule.
Secundaire DNA-structuur (Watson & Crick model: dubbelstrengig)
- 2 anti-parallelle ketens: de ene streng 5’->3’, de andere 3’->5’, blijven aaneen door
H-bruggen tussen de basen (A-T = 2 H-bruggen, C-G = 3 H-bruggen -> GC-rijke
DNA-structuur is dus steviger aaneen gekoppeld)
- dubbelstrengig, de baseparen liggen in 1 vlak loodrecht op de lengterichting
- rechtsdraaiende helixstructuur, stabiliteit dankzij VDW- en hydrofobe interacties
Transcriptie = omzetting van DNA -> mRNA om eiwitten te kunnen vormen
(Translatie = RNA -> eiwit)
Zeer selectief: slechts 1% van het DNA wordt omgezet in mRNA adhv RNA polymerase
(bij zoogdiercellen)
, RNA polymerase = DNA-afhankelijk, vormt een RNA-keten: bindt op een promoter en
synthetiseert een RNA-streng van 5’->3’ tot aan een stopsignaal.
3 RNA polymerasen in eukaryoten:
- RNA polymerase I: maakt rRNA aan
- RNA polymerase II voor transcriptie: DNA -> mRNA: schrijft genen over die vertaald
zullen worden in eiwitten
- RNA polymerase III: maakt oa tRNA aan
mRNA wordt aan 5’ en 3’-uiteinden gemodificeerd om ze te kunnen onderscheiden van de
RNA’s aangemaakt door de andere RNA polymerasen & zo aan te geven dat ze omgezet
moeten worden naar eiwitten
- 5’ cap: aan 5’-uiteinde mRNA wordt vrijwel onmiddellijk een capstructuur gezet door
toevoeging van een gemethyleerd Guanosine (= een 5’-5’ binding!)
deze 5’-cap is belangrijk voor de eiwitsynthese en beschermt RNA tegen degradatie
- 3’ poly A staart: polyadenylatie van mRNA aan 3’-uiteinde:
RNA-polymerase schuift over dubbelstrengig DNA en gaat ondertussen een RNA-
keten vormen die ook een 5’ cap-structuur draagt
RNA-polymerase gaat een polyadenylatiesignaal overschrijven (AAUAAA) dat
herkend wordt door eiwitten die op dat RNA gaan binden waardoor transcriptie stopt
& het mRNA-transcript hier gekliefd wordt door een endonuclease waardoor het
vrijkomt, waarna een ander enzym (polyA polymerase) er een lange A-keten aanzet
(staart van 252 A-nucleotiden) zodat mRNA aan 3’-uiteinde ook beschermd is tegen
afbraak door nucleasen
Naarmate RNA-polymerase over DNA schuift groeit de RNA-keten aan.
Zonder cap-structuur snel afbraak van RNA waardoor geen mRNA.
====> primaire RNA-transcript: precursor voor het uiteindelijke RNA want mRNA ondergaat
nog splicing: als er introns aanwezig zijn gaan de introns verwijderd worden waardoor enkel
coderende exons overblijven die omgezet kunnen worden naar eiwitstructuur.
RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE
ISOLATIE GENOMISCH DNA
DNA-isolatie mbv commercieel verkrijgbare DNA-isolatiekits
Genetisch gewijzigd organisme maken STAP 1: vertrekken van een beetje DNA dat codeert
voor het menselijke gen dat je wil, binnenbrengen in de bacterie opdat die dat zou kunnen
maken
=> dus eerst DNA isoleren van een menselijk staal om zo het gen te kunnen bekomen uit de
bacterie
-> isolatie cellen waarna je de cellen lyseert in een lyse-oplossing: je breekt de cellen open
opdat DNA vrij kan komen, verschillende manieren:
- geïnteresseerd in bacterieel DNA:
● bacteriën brengen in buffer met lysozyme (= breekt celwand bacterie af ) waarna je
Triton X-100 toevoegt (= detergent die membranen oplost) en nadien nog RNase A
toevoegen (= enzymen die RNA afbreken, want je wil enkel DNA).
Dit mengsel bij 37°, 30min omdat lysozyme dan optimaal werkt
