Génie Enzymatique P~7P-th - >~
Exercice 1
TDn°2
<
p l-l p 1-J ê - ';,(f)
On veut séparer trois acides aminés :
L'acide L-lysine, l'acide L-glutamique et l'acide L-leucine sur une résine polystyrénique
substituée par des groupements sulfonate (-SO3).
Les pH isoélectrique des trois acides aminés sont respectivement: 9,74; 3,22 et 5,98 à 25°C.
On dépose ces trois acides aminés sur colonne à pH 2, puis on élue en ramenant
progressivement le pH à 7.
- En considérant les interactions entre les acides aminés et la résine uniquement d'ordre
électrostatiques, quels acides aminés sont élués et dans quel ordre?
Correction
Cet exo met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions, une résine polystyrénique
substituée par des groupements sulfoniques est chargée négativement donc elle échange des
cations.
Lorsque le pH >pHi l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique)
Lorsque le pH< pHi l'acide aminé est chargé positivement forme cationique
Le t abl eau smvant
. · ac1'des ammes
donne 1es charges des tr01s . ' a' pH 2 et a' pH 7
Acide aminé pHi Charge à pH 2 Charge à pH 7
Glu 3,22 + -
~ u 5,98 + -
Lys 9,74 + +
Ainsi à pH 2 les trois acides aminés sont chargés positivement et seront retenus sur la résine
A pH 7 seuls Glu et Leu sont élués la Lys reste fixée sur la colonne,
Donc:
Glu est élué en premier (pHi = 3,22) Leu par la suite (pHi = 5,98).
Exercice 2
Un mélange d'immunoglobuline G (MM=l60000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM=
67000 Da) est déposé sur colonne de Sephadex (G-100) limite d'exclusion= 100000 Da).
- Tracez un diagramme d'élution Vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le
volume mort.
Co rrection
Le diagramme est tracé en utilisant la densité optique (Do) de l' éluat en fonction du volume
d' élution des molécules.
Les IgG représentent une MM supérieure à la valeur de la limité d'exclusion de la colonne
elles seront donc éluées en premier et donneront la valeur du volume mort de la colonne
(Vm= Ve des lgG).
L'albumine de masse moléculaire égale à 67000 g/mol sera incluse dans le gel et éluée plus
tard avec un volume d'élution Ve= Vm + Ve'.
1
, (00)
albutnine
lg G
i\
/ :\
Vm Ve' albumine
(Ve)
Ve albumine
Exercice 3
- Rappelez le principe de l'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes.
- À partir du profil électrophorétique ci-contre, calculez la masse molaire de la protéine
inconnue.
0 dépôt
3
6 205 kDa."
,,-._
9
116 kDa.
12
=
=
..,_,
l5
)8 97,, kDa.
=
Q
·.:,
21
24
~
27 66 kDa.
30
.....6ii 33
=Q)
~
36
39
•~ •inconnue
,s kDa.
,. 42
j 45
.....
~
"'Cl
48
frmd
51
54 nug1ation
57
60
Correction
Principe
SDS - PAGE= sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis
2
Exercice 1
TDn°2
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p l-l p 1-J ê - ';,(f)
On veut séparer trois acides aminés :
L'acide L-lysine, l'acide L-glutamique et l'acide L-leucine sur une résine polystyrénique
substituée par des groupements sulfonate (-SO3).
Les pH isoélectrique des trois acides aminés sont respectivement: 9,74; 3,22 et 5,98 à 25°C.
On dépose ces trois acides aminés sur colonne à pH 2, puis on élue en ramenant
progressivement le pH à 7.
- En considérant les interactions entre les acides aminés et la résine uniquement d'ordre
électrostatiques, quels acides aminés sont élués et dans quel ordre?
Correction
Cet exo met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions, une résine polystyrénique
substituée par des groupements sulfoniques est chargée négativement donc elle échange des
cations.
Lorsque le pH >pHi l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique)
Lorsque le pH< pHi l'acide aminé est chargé positivement forme cationique
Le t abl eau smvant
. · ac1'des ammes
donne 1es charges des tr01s . ' a' pH 2 et a' pH 7
Acide aminé pHi Charge à pH 2 Charge à pH 7
Glu 3,22 + -
~ u 5,98 + -
Lys 9,74 + +
Ainsi à pH 2 les trois acides aminés sont chargés positivement et seront retenus sur la résine
A pH 7 seuls Glu et Leu sont élués la Lys reste fixée sur la colonne,
Donc:
Glu est élué en premier (pHi = 3,22) Leu par la suite (pHi = 5,98).
Exercice 2
Un mélange d'immunoglobuline G (MM=l60000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM=
67000 Da) est déposé sur colonne de Sephadex (G-100) limite d'exclusion= 100000 Da).
- Tracez un diagramme d'élution Vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le
volume mort.
Co rrection
Le diagramme est tracé en utilisant la densité optique (Do) de l' éluat en fonction du volume
d' élution des molécules.
Les IgG représentent une MM supérieure à la valeur de la limité d'exclusion de la colonne
elles seront donc éluées en premier et donneront la valeur du volume mort de la colonne
(Vm= Ve des lgG).
L'albumine de masse moléculaire égale à 67000 g/mol sera incluse dans le gel et éluée plus
tard avec un volume d'élution Ve= Vm + Ve'.
1
, (00)
albutnine
lg G
i\
/ :\
Vm Ve' albumine
(Ve)
Ve albumine
Exercice 3
- Rappelez le principe de l'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes.
- À partir du profil électrophorétique ci-contre, calculez la masse molaire de la protéine
inconnue.
0 dépôt
3
6 205 kDa."
,,-._
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116 kDa.
12
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27 66 kDa.
30
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,. 42
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57
60
Correction
Principe
SDS - PAGE= sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis
2
