GENTECHNOLOGIE
ROB LAVIGNE
Mathieu Cnudde
KU LEUVEN | 2022 - 2023
,HOOFDSTUK 1
1.1 ISOLATIE VAN DE NUCLEÏNEZUREN
INLEIDING: NAAMGEVING VAN DE NUCLEÏNEZUREN
Fosfodiesterverbinding die backbone vormen van NZ
- Fosfaatgroep
- Ribose/deoxyribose
- Stikstof bevattende base
1kb = 0,33 nm lang
Afstand 2,4 nm is belangrijk want fosfaatgroepen en de
locatie ervan is eigenlijk op een heel specifieke manier
geordend.
Als waarneembaar, neemt de dubbelstrengige DNA helix
een antiparallel structuur aan (Figuur 1).
Bij de aanwezigheid van een natuurlijk polymerase
worden dNTP’s herkend obv de template strand en zal er
een interactie worden aangegaan. Dit leidt tot de
vrijstelling van een pyrofosfaat. DNA polymerases zullen verlengen aan een 3’ uiteinde, men start aan 3’OH
uiteinde. DNA pol kan dus niet verlengen aan een 5’ uiteinde. De oriëntatie is dus niet random maar is heel
sterk gedefinieerd.
DNA is de drager vd genetische informatie. Hershey and chase werkten met een bacteriofaag die bacteriën
infecteert. Proteïnen werden T2 radioactief gelabeld en hierna werd E.coli geïnfecteerd. Hiermee zagen ze day
cellen met DNA niet radioactief waren. Dit experiment werd nogmaals uitgevoerd maar nu werd DNA
radioactief gelabeld. Nu zag men dat DNA werd opgenomen en de cellen dus radioactief waren.
1
,BEREIDEN VAN BACTERIEEL DNA
Er zijn 3 globale doelstellingen van gentechnologische bewerkingen
1. EXPLORATIE: Analyse van genoom en signalen (amplificatie van DNA voor bv sequentieanalyse)
→ diagnostiek:
• Prenatale diagnose
• Microbiologische analyse
• Virusidentificatie
2. GEBRUIK: expressie van een eiwit in grote hoeveelheid
→ industriele productie:
• Interferonen, insuline, groeihormoon
• Agarase
• Tal van andere enzymen
3. DESIGN: gerichte wijziging van een organisme in zijn omgeving
→ Biotechnologie:
• Inbouw van nieuwe eigenschappen in planten, dieren, micro-organismen
• Inhibitie van biochemische activiteiten
o EDTA
o Temperatuur verlagen
o Eiwitdenaturerende agentia toevoegen
• Snelle verwijdering van het nucleïnezuur van de rest van het extract
o Fenol, chloroform: tweefasensysteem
o Gebruik van ethanol, isopropanol, spermidine
PEG, CTAB
→ oplosbaarheid vs onoplosbaarheid
→ zout vs zoutloos
→ concentratie-afhankelijk
o Qiagen, Glassmilk
Guanidiniumzouten
Chaotroop agens: vernietigt de 3D structuur van proteinen
→ guanidinium hydrochloride: sterke inhibitor van RNase
→ guanidinium (iso) thiocyanaat: nog sterker chaotroop, denatureert vrijwel alle celcomponenten
behalve nucleïnezuur.
DEPC (di-ethylpyrocarbonaat)
Sterk alkylerend agens
→ ethoxyformylering van histidylgroepen, vormt ook adducten met N7 van niet-gepaarde purines.
→ vooral voor behandeling van glaswerk en sommige oplossingen
VRC (vanadylribonucleoside complex: “transition state analog”
→ bindt aan de actieve plaats van Rnasen en inhibeert de katalytische activiteit nagenoeg volledig
→ vooral vroeger gebruikt bij mRNA isolatie voor cDNA klonering
Proteine-inhibitoren van Rnase: ongeveer 5àkb, uit het cytoplasma van bijna alle zoogdierweefsels
2
, BEREIDEN VAN BACTERIEEL DNA
Process:
Een belangrijke stap hierbij is natuurlijk de cellyse. Hoe kunnen we op een specifieke manier de celwand
breken zodanig dat we het celextract krijgen en hoe kunnen we in een verdere stap het celdebris scheiden van
ons DNA, RNA en eiwitten. En hoe kunnen we dan verder ons celextract, ons DNA gaan isoleren. Die isolatie
van celextract is op een heel basische manier mogelijk. Dit is door het celextract eigenlijk te gaan mengen met
fenol. Dat mengsel gaat zich na goed schudden geleidelijk gaan scheiden in 2 lagen. Fenol is zwaarder dan
water bevattende oplossing en dus op deze manier zal na rust, verschillende lagen na centrifugatie verkregen
worden. Eiwitten (hydrofoob en hydrofiel) bevinden zich in interface tussen fenol en waterfase. Terwijl
waterige oplossing het nucleïnezuur zal bevatten.
1ste stap:
- Vernietigen van celwand
o Cytoplasmamembraan
o Peptidoglycaanlaag: geeft structuur aan de bacterie
o Gram negatieve buiten membraan
→ deze 3 elementen moeten overwonnen worden om de cel te breken
3
ROB LAVIGNE
Mathieu Cnudde
KU LEUVEN | 2022 - 2023
,HOOFDSTUK 1
1.1 ISOLATIE VAN DE NUCLEÏNEZUREN
INLEIDING: NAAMGEVING VAN DE NUCLEÏNEZUREN
Fosfodiesterverbinding die backbone vormen van NZ
- Fosfaatgroep
- Ribose/deoxyribose
- Stikstof bevattende base
1kb = 0,33 nm lang
Afstand 2,4 nm is belangrijk want fosfaatgroepen en de
locatie ervan is eigenlijk op een heel specifieke manier
geordend.
Als waarneembaar, neemt de dubbelstrengige DNA helix
een antiparallel structuur aan (Figuur 1).
Bij de aanwezigheid van een natuurlijk polymerase
worden dNTP’s herkend obv de template strand en zal er
een interactie worden aangegaan. Dit leidt tot de
vrijstelling van een pyrofosfaat. DNA polymerases zullen verlengen aan een 3’ uiteinde, men start aan 3’OH
uiteinde. DNA pol kan dus niet verlengen aan een 5’ uiteinde. De oriëntatie is dus niet random maar is heel
sterk gedefinieerd.
DNA is de drager vd genetische informatie. Hershey and chase werkten met een bacteriofaag die bacteriën
infecteert. Proteïnen werden T2 radioactief gelabeld en hierna werd E.coli geïnfecteerd. Hiermee zagen ze day
cellen met DNA niet radioactief waren. Dit experiment werd nogmaals uitgevoerd maar nu werd DNA
radioactief gelabeld. Nu zag men dat DNA werd opgenomen en de cellen dus radioactief waren.
1
,BEREIDEN VAN BACTERIEEL DNA
Er zijn 3 globale doelstellingen van gentechnologische bewerkingen
1. EXPLORATIE: Analyse van genoom en signalen (amplificatie van DNA voor bv sequentieanalyse)
→ diagnostiek:
• Prenatale diagnose
• Microbiologische analyse
• Virusidentificatie
2. GEBRUIK: expressie van een eiwit in grote hoeveelheid
→ industriele productie:
• Interferonen, insuline, groeihormoon
• Agarase
• Tal van andere enzymen
3. DESIGN: gerichte wijziging van een organisme in zijn omgeving
→ Biotechnologie:
• Inbouw van nieuwe eigenschappen in planten, dieren, micro-organismen
• Inhibitie van biochemische activiteiten
o EDTA
o Temperatuur verlagen
o Eiwitdenaturerende agentia toevoegen
• Snelle verwijdering van het nucleïnezuur van de rest van het extract
o Fenol, chloroform: tweefasensysteem
o Gebruik van ethanol, isopropanol, spermidine
PEG, CTAB
→ oplosbaarheid vs onoplosbaarheid
→ zout vs zoutloos
→ concentratie-afhankelijk
o Qiagen, Glassmilk
Guanidiniumzouten
Chaotroop agens: vernietigt de 3D structuur van proteinen
→ guanidinium hydrochloride: sterke inhibitor van RNase
→ guanidinium (iso) thiocyanaat: nog sterker chaotroop, denatureert vrijwel alle celcomponenten
behalve nucleïnezuur.
DEPC (di-ethylpyrocarbonaat)
Sterk alkylerend agens
→ ethoxyformylering van histidylgroepen, vormt ook adducten met N7 van niet-gepaarde purines.
→ vooral voor behandeling van glaswerk en sommige oplossingen
VRC (vanadylribonucleoside complex: “transition state analog”
→ bindt aan de actieve plaats van Rnasen en inhibeert de katalytische activiteit nagenoeg volledig
→ vooral vroeger gebruikt bij mRNA isolatie voor cDNA klonering
Proteine-inhibitoren van Rnase: ongeveer 5àkb, uit het cytoplasma van bijna alle zoogdierweefsels
2
, BEREIDEN VAN BACTERIEEL DNA
Process:
Een belangrijke stap hierbij is natuurlijk de cellyse. Hoe kunnen we op een specifieke manier de celwand
breken zodanig dat we het celextract krijgen en hoe kunnen we in een verdere stap het celdebris scheiden van
ons DNA, RNA en eiwitten. En hoe kunnen we dan verder ons celextract, ons DNA gaan isoleren. Die isolatie
van celextract is op een heel basische manier mogelijk. Dit is door het celextract eigenlijk te gaan mengen met
fenol. Dat mengsel gaat zich na goed schudden geleidelijk gaan scheiden in 2 lagen. Fenol is zwaarder dan
water bevattende oplossing en dus op deze manier zal na rust, verschillende lagen na centrifugatie verkregen
worden. Eiwitten (hydrofoob en hydrofiel) bevinden zich in interface tussen fenol en waterfase. Terwijl
waterige oplossing het nucleïnezuur zal bevatten.
1ste stap:
- Vernietigen van celwand
o Cytoplasmamembraan
o Peptidoglycaanlaag: geeft structuur aan de bacterie
o Gram negatieve buiten membraan
→ deze 3 elementen moeten overwonnen worden om de cel te breken
3
