Les 4
Proces van genotypering
In de vorige les hebben we gezien hoe we de DNA-fragmenten scheiden door capillaire elektroforese
en hoe we de verschillende fluorescente labels kunnen scheiden. Hoe gaan we nu het DNA-profiel
interpreteren als we deze resultaten hebben? In deze les gaan we kijken hoe we de lengte van elk
fragment kunnen bepalen; hoe we de fragmenten kunnen vergelijken met de allelische ladder; en
hoe we de allelen gaan benoemen. Hierna worden de resultaten ook nog geverifieerd door een
tweede persoon, zodat er geen fouten worden gemaakt en dat de geïnterpreteerde data ook correct
gaan zijn.
Analyse van de capillaire elektroforese data – Fragment analyse
De formamide oplossing moet een bepaalde kwaliteit hebben, zodat het DNA goed wordt opgezogen
in de capillairen door het aanleggen van een spanning. We hebben verschillende componenten nodig
voor de fragment analyse en de genotypering:
Elk staal die uit de capillaire elektroforese is
gekomen, bevat naast formamide en het PCR-
product ook een ‘Internal Lane Standard’
(ILS). Deze ILS is essentieel voor het bepalen
van de lengte van de PCR-fragmenten.
Wanneer we een andere fluorescent label zien
dan de te analyseren PCR-producten, hebben
we overlap met de andere PCR-fragmenten
De Internal Lane Standard (ILS) is een synthetische mix
van verschillende fragmenten van een gekende lengte.
Hiermee kunnen we een grafiek opstellen in functie
van de gekende lengte en de migratie in de capillair.
Voor de fragmenten in het staal kan men nu de lengte
van bepalen, dit wordt berekend door software.
Elke reeks van analyses bevat ten minste één staal die uit de capillaire elektroforese is
gekomen met, naast formamide en ILS, ook een ‘allelische’ ladder. Dit bevat de lengtes van
de meest belangrijke allelen en wordt dan ook wel de synthetische standaard genoemd
Een allelische ladder wordt ontwikkeld door een artificieel mengsel van verschillende frequent
voorkomende STR allelen. Hierin zit dezelfde primer set als die gebruikt wordt in de multiplex kit voor
de analyse van onbekende stalen. Ook is het exact aantal herhalingsmotieven gekend van elk
fragment (gekende STR allelen) via sequentie analyse, zo weten wij exact hoeveel
herhalingsmotieven aanwezig zijn in de ladder. Tijdens
het ontwikkelen van de ladder, wordt er ook een
populatie studie gebruikt, dit is essentieel om het
aantal frequente allelen te kennen. We nemen
honderden individuen en voeren een fragment analyse
uit met dezelfde primer set. Zo kunnen we zien welke
fragmenten we zien binnen die honderden personen.
Voor elk staal kunnen we zien hoeveel PCR-producten
er zijn geproduceerd. We nemen gelijke hoeveelheden
van deze individuele PCR-reacties en gaan hier
opnieuw de PCR voor uitvoeren met dezelfde primer
set. Nu krijgen we de allelische ladder. Dit is de werking voor één STR, dus dit moet vaak gebeuren
voor alle te onderzoeken STRs in een kit.
Proces van genotypering
Nu we de lengte hebben bepaald en de fragmenten hebben vergeleken met de allelische ladder, is de
volgende stap om de allelen uit ons PCR-staal te gaan benoemen.
Pagina 1 van 9
Proces van genotypering
In de vorige les hebben we gezien hoe we de DNA-fragmenten scheiden door capillaire elektroforese
en hoe we de verschillende fluorescente labels kunnen scheiden. Hoe gaan we nu het DNA-profiel
interpreteren als we deze resultaten hebben? In deze les gaan we kijken hoe we de lengte van elk
fragment kunnen bepalen; hoe we de fragmenten kunnen vergelijken met de allelische ladder; en
hoe we de allelen gaan benoemen. Hierna worden de resultaten ook nog geverifieerd door een
tweede persoon, zodat er geen fouten worden gemaakt en dat de geïnterpreteerde data ook correct
gaan zijn.
Analyse van de capillaire elektroforese data – Fragment analyse
De formamide oplossing moet een bepaalde kwaliteit hebben, zodat het DNA goed wordt opgezogen
in de capillairen door het aanleggen van een spanning. We hebben verschillende componenten nodig
voor de fragment analyse en de genotypering:
Elk staal die uit de capillaire elektroforese is
gekomen, bevat naast formamide en het PCR-
product ook een ‘Internal Lane Standard’
(ILS). Deze ILS is essentieel voor het bepalen
van de lengte van de PCR-fragmenten.
Wanneer we een andere fluorescent label zien
dan de te analyseren PCR-producten, hebben
we overlap met de andere PCR-fragmenten
De Internal Lane Standard (ILS) is een synthetische mix
van verschillende fragmenten van een gekende lengte.
Hiermee kunnen we een grafiek opstellen in functie
van de gekende lengte en de migratie in de capillair.
Voor de fragmenten in het staal kan men nu de lengte
van bepalen, dit wordt berekend door software.
Elke reeks van analyses bevat ten minste één staal die uit de capillaire elektroforese is
gekomen met, naast formamide en ILS, ook een ‘allelische’ ladder. Dit bevat de lengtes van
de meest belangrijke allelen en wordt dan ook wel de synthetische standaard genoemd
Een allelische ladder wordt ontwikkeld door een artificieel mengsel van verschillende frequent
voorkomende STR allelen. Hierin zit dezelfde primer set als die gebruikt wordt in de multiplex kit voor
de analyse van onbekende stalen. Ook is het exact aantal herhalingsmotieven gekend van elk
fragment (gekende STR allelen) via sequentie analyse, zo weten wij exact hoeveel
herhalingsmotieven aanwezig zijn in de ladder. Tijdens
het ontwikkelen van de ladder, wordt er ook een
populatie studie gebruikt, dit is essentieel om het
aantal frequente allelen te kennen. We nemen
honderden individuen en voeren een fragment analyse
uit met dezelfde primer set. Zo kunnen we zien welke
fragmenten we zien binnen die honderden personen.
Voor elk staal kunnen we zien hoeveel PCR-producten
er zijn geproduceerd. We nemen gelijke hoeveelheden
van deze individuele PCR-reacties en gaan hier
opnieuw de PCR voor uitvoeren met dezelfde primer
set. Nu krijgen we de allelische ladder. Dit is de werking voor één STR, dus dit moet vaak gebeuren
voor alle te onderzoeken STRs in een kit.
Proces van genotypering
Nu we de lengte hebben bepaald en de fragmenten hebben vergeleken met de allelische ladder, is de
volgende stap om de allelen uit ons PCR-staal te gaan benoemen.
Pagina 1 van 9
