Biotechnologie Les 2: From gene to protein
Recap
Als je P en H gebruikt heb je 2 opties problemen.
Restrict X en P: overhangs niet compatibel
ongewoon om iets te binden, anders dan originele site.
Zelfde restrictie in destination vector, maar deze keer met behoud van de vector zelf ipv fragment.
Fragment isoleren van source vector en backbone van destination vector samen zetten en
opnieuw ligeren.
pUC systeem
= circulair, bacterieel plasmide (gebruikt voor klonen)
- Gegenereerd met klassieke methode
- Meerder cloning sites (MCS) binnen LacZα reporter.
- Hoog aantal kopieën (80-300 kopieën per cel)
o Plasmiden: hoeveel kopieën van plasmide per individuele cel
Ori = origin of replication = levensvatbaar blijven
ApR = antibiotic resistance marker
Alles wat je in reporter kloont zal gen onderbreken gen werkt niet meer.
Klonen: gen van interesse toegevoegd aan vector, dit te versterken
Biobrick systeem
Output van assemblage kan input zijn van volgende assemblage.
X- en S-overhangen cut-and-ligate vernietiging beide endonuclease restrictie-plaatsen SCAR =
kan door geen van beide enzymen aangevallen worden
- Limiet van kracht van biobrick
Verschil biobrick clonen en klassiek moleculair clonen?
- Beiden = orthodox type II endonuclease: cut in planidromische herkenningsplaats.
- Verschil in design, wel zelfde gebruik van enzymen.
o Klassiek = vertrouwt op bestaand cut-sites en aangepast om individuele problemen
op te lossen.
o Biobrick creëerde een standaard (standaardcontext van enzymen om optimalisatie
en reproduceerbaarheid te verbeteren, standaardwerkwijze om
reproduceerbaarheid te verbeteren en kost te verlagen,…)
, Biotechnologie Les 2: From gene to protein
PCR
DNA polymerase
= synthese DNA via RNA
- Templaat-afhankelijke DNA synthese
o Replicatie
o Repair (herstellen)
o Reverse transcriptie
- 7 familie door homologie
o Gemeenschappelijk mechanisme
o Gemeenschappelijke structurele elementen en algehele topologie
Rechterhand
Palm subdomein: meest geconserveerde structuur tussen polymerasen
o Familie specifieke domeinen
= controleert snelheid van nucleotide incorporatie
= houdt duplex vast
= controleert of DNA in actieve site blijft of verplaatst naar
additionele domeinen
covid = RNA virus: converteren naar DNA (reverse transcriptase) + amplificeren (replicatie).
Algemeen polymerase
- Natuurlijke polymerasen afhankelijk van triP als geactiveerde monomeren.
- Precieze katalytische site geometrie activering 3’-OH nucleofiele aanval op α-P.
- Pyrofosfaat (βγ) worden afgevoerd = leaving groep opgesliptst in 2 fosfaten.
A-familie DNA-polymerase B-familie DNA-polymerase
Biologische functie Biologische functie
- Replicatie (T7-faag) - Replicatie (T4 en phi29 fagen, gist)
- Reparatie en verwerking Okazaki- - Reparatie (E. Coli)
fragmenten (E. Coli Pol I)
Thermus aquaticus DNA polymerase I = Taq Pyrococcus furiosus DNA polymerase (Pfu)
- Werkpaard voor moleculaire biologie - T1/2 > 1h bij 97,5°C (thermostabielere)
- T1/2 = 1,5min bij 97,5°C (thermostabiel: - 6,5 incorporaties per binding event
voor biotechnologie) (lagere DNA-aff)
- 22 incorporaties per binding event - Error rate: 3 x 10-5 per base
(hoge DNA-aff: eraf en herbinden) (betrouwbaarder)
- Error rate: 3 x 10-4 per base = hoge - Detectie limiet: 100 kopieën
betrouwbaarheid - 3’ 5’ exonuclease = proofreading
- In staat: single templates detecteren - Blund end
(hoge DNA-aff: forensisch)
- 5’ 3’ exonuclease
- Laat 3’A overhang achter (of G)
DNA polymerase 5’ 3’ // 3’ 5’ exonuclease omgekeerde richting van synthese: foutencorrectie.
5’ 3’ exonuclease: geen DNA foutencorrectie maar blokkade: alles voor DNA polymerase vernietig.
Exonuclease = werkt als nuclease (hydrolyse DNA bij overbruggende P) vanaf uiteinden.
Recap
Als je P en H gebruikt heb je 2 opties problemen.
Restrict X en P: overhangs niet compatibel
ongewoon om iets te binden, anders dan originele site.
Zelfde restrictie in destination vector, maar deze keer met behoud van de vector zelf ipv fragment.
Fragment isoleren van source vector en backbone van destination vector samen zetten en
opnieuw ligeren.
pUC systeem
= circulair, bacterieel plasmide (gebruikt voor klonen)
- Gegenereerd met klassieke methode
- Meerder cloning sites (MCS) binnen LacZα reporter.
- Hoog aantal kopieën (80-300 kopieën per cel)
o Plasmiden: hoeveel kopieën van plasmide per individuele cel
Ori = origin of replication = levensvatbaar blijven
ApR = antibiotic resistance marker
Alles wat je in reporter kloont zal gen onderbreken gen werkt niet meer.
Klonen: gen van interesse toegevoegd aan vector, dit te versterken
Biobrick systeem
Output van assemblage kan input zijn van volgende assemblage.
X- en S-overhangen cut-and-ligate vernietiging beide endonuclease restrictie-plaatsen SCAR =
kan door geen van beide enzymen aangevallen worden
- Limiet van kracht van biobrick
Verschil biobrick clonen en klassiek moleculair clonen?
- Beiden = orthodox type II endonuclease: cut in planidromische herkenningsplaats.
- Verschil in design, wel zelfde gebruik van enzymen.
o Klassiek = vertrouwt op bestaand cut-sites en aangepast om individuele problemen
op te lossen.
o Biobrick creëerde een standaard (standaardcontext van enzymen om optimalisatie
en reproduceerbaarheid te verbeteren, standaardwerkwijze om
reproduceerbaarheid te verbeteren en kost te verlagen,…)
, Biotechnologie Les 2: From gene to protein
PCR
DNA polymerase
= synthese DNA via RNA
- Templaat-afhankelijke DNA synthese
o Replicatie
o Repair (herstellen)
o Reverse transcriptie
- 7 familie door homologie
o Gemeenschappelijk mechanisme
o Gemeenschappelijke structurele elementen en algehele topologie
Rechterhand
Palm subdomein: meest geconserveerde structuur tussen polymerasen
o Familie specifieke domeinen
= controleert snelheid van nucleotide incorporatie
= houdt duplex vast
= controleert of DNA in actieve site blijft of verplaatst naar
additionele domeinen
covid = RNA virus: converteren naar DNA (reverse transcriptase) + amplificeren (replicatie).
Algemeen polymerase
- Natuurlijke polymerasen afhankelijk van triP als geactiveerde monomeren.
- Precieze katalytische site geometrie activering 3’-OH nucleofiele aanval op α-P.
- Pyrofosfaat (βγ) worden afgevoerd = leaving groep opgesliptst in 2 fosfaten.
A-familie DNA-polymerase B-familie DNA-polymerase
Biologische functie Biologische functie
- Replicatie (T7-faag) - Replicatie (T4 en phi29 fagen, gist)
- Reparatie en verwerking Okazaki- - Reparatie (E. Coli)
fragmenten (E. Coli Pol I)
Thermus aquaticus DNA polymerase I = Taq Pyrococcus furiosus DNA polymerase (Pfu)
- Werkpaard voor moleculaire biologie - T1/2 > 1h bij 97,5°C (thermostabielere)
- T1/2 = 1,5min bij 97,5°C (thermostabiel: - 6,5 incorporaties per binding event
voor biotechnologie) (lagere DNA-aff)
- 22 incorporaties per binding event - Error rate: 3 x 10-5 per base
(hoge DNA-aff: eraf en herbinden) (betrouwbaarder)
- Error rate: 3 x 10-4 per base = hoge - Detectie limiet: 100 kopieën
betrouwbaarheid - 3’ 5’ exonuclease = proofreading
- In staat: single templates detecteren - Blund end
(hoge DNA-aff: forensisch)
- 5’ 3’ exonuclease
- Laat 3’A overhang achter (of G)
DNA polymerase 5’ 3’ // 3’ 5’ exonuclease omgekeerde richting van synthese: foutencorrectie.
5’ 3’ exonuclease: geen DNA foutencorrectie maar blokkade: alles voor DNA polymerase vernietig.
Exonuclease = werkt als nuclease (hydrolyse DNA bij overbruggende P) vanaf uiteinden.
