samenvatting mol. diagnostiek (2)

Les 1
Verandering in genoom

Mutations (sequence variations) can cause disease:
1. punt mutatie (SNP)
 silent mutatie
 missense mutatie
 nonsense mutatie
2. small scale mutations
* insertions & deletions
3. large-scale mutations
* amplifications & chromosomal translocatie

• Substitutie: één nucleotide is vervangen door één andere nucleotide
• Deletie: één of meerdere nucleotides niet aanwezig zijn
• Duplicatie: een kopie van één of meerdere nucleotides is geplaats op precies 3’ van de
originele kopie van de sequentie
• Insertie: één of meerdere nucleotides zijn geplaatst in een sequentie en deze nucleotides zijn
geen kopie van de nucleotiden direct 5’
• Deletie-insertie (indel): één of meerdere nucleotides zijn vervangen door een of meerdere
andere nucleotiden, en het geen substitutie, inversie of conversie is
• Inversie: meer dan 1 nucleotides vervangen de originele sequentie en deze sequentie is de
reverse-complement van de originele sequentie (bijv CTCGAG naar TCGAG)
• Conversie (een specifieke indel): een reeks nucleotiden van de originele sequentie is
vervangen door een reek nucleotiden van een homologe sequentie op een andere plek van
het genoom
• Translocatie: de sequentie van een chromosoom is samengevoegd met dat van een ander
chromosoom

Karotypering; Detectie van aneuploïdie en translocatie. Voor tumordiagnosiek; kleuren van
chromsomen (SKY)kleurstoffen binden specifieke stukken DNA  hybridisatie.

Hybridisatie
1. dubbelstrengs DNA van patiënt
2. Denatureren
3. hybridiseren met gelabelde probe

Hybridisatie; FISH
Veranderingen genoom: PCR  detectie van kleine hoeveelheden DNA/RNA

Verhogen van gevoeligheid; signaal amplificatie
Vermeerdering van target: target amplificatie

PCR = polymerase chain reaction
Exponentiële toename van een target DNA, vermeningvuldigen met facter 2^n per n cycli. Na 35 cycli
= 34 miljard (voorbeeld)

,PCR cyclus:
1. denaturatie (94 graden)
2. annealing
3. elongatie (72 graden)
Beïndigen

Analyse van PCR
1. aantonen van een pcr product (kleuring met ethiduumbromide)
2. identificeren van een pcr product (hybridiatie met een gelabelde probe)

Speciale PCR:
multiplex PCR  meerdere primersets in 1 PCR reactie. Binnen 1 monster kunnen meerdere
bepalingen worden gedaan. Grote kans op niet specifieke producten.

Detectietechnieken

 Direct (absotptie bij 260 nm), fluorescene kleurstoffen.
 Indirect; hybridisatie met probes of immunologisch met antilichamen

Detectie van hybridisatie:

 Direct = elektronenmicroscoop
 Indirect via gelabelde probes;

Radio-isotopen > autoradiografie
Fluorochromen > fluorescentiemeting
Haptenen > specifieke antilichamen
Enzymen > substraatomzetting: - spectrofotometrie
- luminescentie
- gekleurd neerslag
Scheidingstechnieken
Elektroforese; Southern (DNA) en northern blot (RNA) & DNA sequencing; Sanger sequencing

DNA polymorphism
Er zijn grote verschillen in DNA tussen mensen; dit komt omdat 98% van ons DNA niet codeert voor
genen. Ongeveer 1000 tot 1500 bp in ons genoom is verschillend, dit noemen we SNP’s (single
nucleotide polymorfisme).
Naast SNP’s hebben wij verschillende repeterende stukken DNA warvan iedereen een ander aantal
repetities heeft.

Les 2
DNA polymorfisme
Grote verschillen in DNA tussen mensen, 98% van ons DNA is niet coderent voor genen. Ongeveer
elke 1000 ene 1500 bp is in ons genoom verschillend.

Human identificatie:

, Waarom:
* forensische vraagstukken;
- is het van een verdachte
- niet te identificeren menselijke resten
- oude graven
* klinische vraagstukken;
- is het monster van patiënt A?
- testen van donoren voor orgaan donatie
- testen van o.a. T-cellen na beenmergtransplantatie
*persoonlijke vraagstukken
- wie is de vader?

Vroeger…eiwitten:
* ABO en rhesus
* HLA
* polymorfe eiwit systemen

Uiteindelijk slecht 10 polymorfe eiwitmarkers
Nadelen:
- onderscheidbaar vermogen 1 op 1000
- biologische ‘sporen’ onbruikbaar
- sperma: slechts 2 poly morfe eiwitmarkers (ABO en PGM)

DNA profile = info over kleine stukjes van het DNA van een individu
Databank = NL; DNA-databank NFI
Wat wordt bewaard, zowel het digitale profiel als het biologische materiaal

Genetische verschillen tussen mensen door:

- HLA (DNA)
- VNTR’s
- STRs
- RFLP
- SNP’s

Allelen en loci
Locus: een gen of regio in het DNA
Allel: versie van een locus
Mensen zijn diploid, dus elk locus heeft 2 allelen
Repetitief DNA
Niet coderend DNA bevat 40% repetitief DNA. Minisatelliet DNA: repeats met ‘’blokjes’’ van 10 tot 60
bp  VNTR’s. Detecteren met restrictie enzymen en Southern blot (oud techniek).
Microsatelliet DNA; repeats met ‘’blokjes’’ van 2 tot 10 bp (STR’s). komen voor……

RFLP
Oude techniek om verschillen in DNA aan te tonen. SNP’s zijn verantwoordelijknvoor het
introduceren of verwijderen van een restrictie. Door meerdere restrictionsites te ‘’mappen’ kan een
DNA profiel gemaakt worden. Techniek gebaseerd op southern blot