Therapeutische eiwitten
FA-MA201
Structuur en stabiliteit
Aminozuren: bouwblokken voor eiwitten
- α-aminozuren: functionele groepen gescheiden
door 1 koolstofatoom
o Functionele groepen
▪ Carboxyl -COOH
▪ Amino -NH2
▪ Zijketen ‘R’
o Sp3 hybridizatie
o Centraal C-atoom is altijd chirale C; optisch centrum
▪ Uitzondering: glycine heeft -H als zijketen; niet chiraal
o In natuur komen alle L-geconfigureerde aminozuren voor
▪ Uitzondering: cysteïne heeft R-configuratie
▪ Bij verandering configuratie verandert vouwing en dus biologische activiteit van het eiwit
- Indeling op basis van zijketen; bepaling eigenschappen van eiwit
o Nonpolaire zijketens
▪ Glycine
• R= H; geen chiraal aminozuur
▪ Alanine
▪ Valine
▪ Leucine
▪ Isoleucine
▪ Methionine
▪ Proline
• β-sheet breker: voorkomt neerslag β-sheetgevoelige ketens → wateroplosbaarheid eiwit ↑
▪ Phenylalanine
▪ Tryptofaan
o Polaire zijketens
▪ Amide-zijketen; geen zuur/base → neutraal bij fysiologische pH
• Asparagine
• Glutamine Sterkte van bindingssoorten
▪ Alcohol-zijketen Covalente binding > ionogene
• Serine binding/elektrostatische interactie >
• Threonine waterstofbrug >
Vanderwaalskracht/hydrofobe
• Tyrosine
interactie
▪ Vorming zwavelbruggen mogelijk
• Cysteïne
o Zure zijketens fysiologische pH: gedeprotoneerd [A-]
▪ Asparaginezuur pKa ~ 4; carboxylgroep
▪ Glutaminezuur pKa ~ 4; carboxylgroep
o Basische zijketens fysiologische pH: geprotoneerd [BH+]
▪ Arginine pKa ~ 12; sterkste base
▪ Histidine pKa ~ 7
▪ Lysine pKa ~ 10
1 - 53
,Indeling aminozuren
Eiwit-backbone: polymeer van aminozuren
- Weergave: links N-terminus rechts C-terminus
o C-terminus: carboxylgroep -COOH
▪ Fysiologische pH: gedeprotoneerd -COO- carboxylaat ion
o N-terminus: aminegroep -NH2
▪ Fysiologische pH: gedeprotoneerd -NH3+ ammonium ion
- Iso-elektrisch punt (pI): pH waarbij lading van het totale eiwit netto gelijk is aan 0 1 Amidebinding
o pI = pH → lading = 0 →
wateroplosbaarheid ↓
o Bruikbaar bij opzuiveren van eiwit;
eiwit met juiste pI slaat neer,
overige stoffen blijven in oplossing
en kunnen weggespoeld worden
- Amidebindingen
2 Links: volledig geprotoneerd, rechts: volledig gedeprotoneerd, midden: iso-elektrisch
o Starre binding punt
▪ Door resonantie altijd
ongeladen; verschuiving van vrije π -elektronen
2 - 53
, ▪ Geen vrije rotatie mogelijk
o Trans-configuratie: meest stabiel
o Cis-configuratie: minder stabiel
▪ Te behalen door ongecontroleerde
temperatuursverhoging:
overkomen van energiebarrière →
denaturatie
Primaire structuur: aminozuursequentie
Secundaire structuren
- α helices
o Nauwelijks van invloed op
wateroplosbaarheid
o α-sheet bevorderende aminozuren
▪ Alanine
▪ Lysine
▪ Leucine
▪ Glutaminezuur
- β sheets
o Intrinsieke instabiliteit
van een eiwit; β-
sheetvorming
nauwelijks tegen te
gaan, tenzij je de
veroorzaker weet
o Vermindert
wateroplosbaarheid
o β-sheet bevorderende
aminozuren: “β-
branched aminozuren”
▪ Valine
▪ Isoleucine
▪ Threonine
Tertiaire structuur: 3D vouwing
Quaternaire structuur: wanneer eiwit bestaat uit meerdere peptideketens (subunits) die aggregeren tot één
eiwitcomplex
Aanpassingen eiwit Effect
pH verandering Verstoring elektrostatische interacties
Extrinsiek Denaturantia toevoegen Verstoring waterstofbruggen
Temperatuurschommelingen Verstoring waterstofbruggen
β-sheet breker: voorkomt neerslag van β-sheetgevoelige
Intrinsiek Insertie aminozuur proline
ketens → wateroplosbaarheid ↑
3 - 53
, Degradatie van eiwitten
Chemische instabiliteit
Proteolyse
- Afbraak door enzymen
- Trypsine: knipt na lysine en arginine
- Chymotrypsine: knipt na fenylalanine, tyrosine en tryptofaan
Hydrolyse
- Voor veel eiwitten pH > 8 desastreus
- Lage pH: water als H2O; slechte nucleofiel langzaam proces
- Hoge pH: water als OH ; goede nucleofiel
- sneller proces
o Deamidatie van zijketens asparagine en glutamine
▪ Risico na deamidatie → ringvorming
▪ Ringvorm: succinimidyl peptide
▪ Voorbeeld asparagine – glycine
• Kan op twee manieren opensplitsen
• Manier 1: ontstaan -COOH eindgroep en behoud
peptide backbone aspartyl peptide
o Introductie negatieve lading {-COO-}
• Manier 2: verplaatsing peptide backbone
isoaspartyl peptide
- Beïnvloedende factor: pH
3 Zure hydrolyse
5 Basische hydrolyse
4 Isomerisatie na deamidatie van asparagine
Deamidatie/isomerisatie
- Aminozuren met amide zijketen: asparagine, glutamine
o Deamidatie; amidegroep verdwijnt, uitwisseling voor
carboxylgroep; introductie van lading {-COO-}
- Asparagine – proline
o Combinatie valt spontaan uiteen bij zure pH
o Waar mogelijk sequentie voorkomen in therapeutische
eiwitten
- N-terminaal glutamine
o Wordt pyroglutamyl; basische zijketen
o Wordt amide; niet meer basisch
o Waar mogelijk asparagine op N-terminus als een
basisch uiteinde van belang is
- Beïnvloedende factor: pH (tussen pH 3 en 6 het minst)
4 - 53
FA-MA201
Structuur en stabiliteit
Aminozuren: bouwblokken voor eiwitten
- α-aminozuren: functionele groepen gescheiden
door 1 koolstofatoom
o Functionele groepen
▪ Carboxyl -COOH
▪ Amino -NH2
▪ Zijketen ‘R’
o Sp3 hybridizatie
o Centraal C-atoom is altijd chirale C; optisch centrum
▪ Uitzondering: glycine heeft -H als zijketen; niet chiraal
o In natuur komen alle L-geconfigureerde aminozuren voor
▪ Uitzondering: cysteïne heeft R-configuratie
▪ Bij verandering configuratie verandert vouwing en dus biologische activiteit van het eiwit
- Indeling op basis van zijketen; bepaling eigenschappen van eiwit
o Nonpolaire zijketens
▪ Glycine
• R= H; geen chiraal aminozuur
▪ Alanine
▪ Valine
▪ Leucine
▪ Isoleucine
▪ Methionine
▪ Proline
• β-sheet breker: voorkomt neerslag β-sheetgevoelige ketens → wateroplosbaarheid eiwit ↑
▪ Phenylalanine
▪ Tryptofaan
o Polaire zijketens
▪ Amide-zijketen; geen zuur/base → neutraal bij fysiologische pH
• Asparagine
• Glutamine Sterkte van bindingssoorten
▪ Alcohol-zijketen Covalente binding > ionogene
• Serine binding/elektrostatische interactie >
• Threonine waterstofbrug >
Vanderwaalskracht/hydrofobe
• Tyrosine
interactie
▪ Vorming zwavelbruggen mogelijk
• Cysteïne
o Zure zijketens fysiologische pH: gedeprotoneerd [A-]
▪ Asparaginezuur pKa ~ 4; carboxylgroep
▪ Glutaminezuur pKa ~ 4; carboxylgroep
o Basische zijketens fysiologische pH: geprotoneerd [BH+]
▪ Arginine pKa ~ 12; sterkste base
▪ Histidine pKa ~ 7
▪ Lysine pKa ~ 10
1 - 53
,Indeling aminozuren
Eiwit-backbone: polymeer van aminozuren
- Weergave: links N-terminus rechts C-terminus
o C-terminus: carboxylgroep -COOH
▪ Fysiologische pH: gedeprotoneerd -COO- carboxylaat ion
o N-terminus: aminegroep -NH2
▪ Fysiologische pH: gedeprotoneerd -NH3+ ammonium ion
- Iso-elektrisch punt (pI): pH waarbij lading van het totale eiwit netto gelijk is aan 0 1 Amidebinding
o pI = pH → lading = 0 →
wateroplosbaarheid ↓
o Bruikbaar bij opzuiveren van eiwit;
eiwit met juiste pI slaat neer,
overige stoffen blijven in oplossing
en kunnen weggespoeld worden
- Amidebindingen
2 Links: volledig geprotoneerd, rechts: volledig gedeprotoneerd, midden: iso-elektrisch
o Starre binding punt
▪ Door resonantie altijd
ongeladen; verschuiving van vrije π -elektronen
2 - 53
, ▪ Geen vrije rotatie mogelijk
o Trans-configuratie: meest stabiel
o Cis-configuratie: minder stabiel
▪ Te behalen door ongecontroleerde
temperatuursverhoging:
overkomen van energiebarrière →
denaturatie
Primaire structuur: aminozuursequentie
Secundaire structuren
- α helices
o Nauwelijks van invloed op
wateroplosbaarheid
o α-sheet bevorderende aminozuren
▪ Alanine
▪ Lysine
▪ Leucine
▪ Glutaminezuur
- β sheets
o Intrinsieke instabiliteit
van een eiwit; β-
sheetvorming
nauwelijks tegen te
gaan, tenzij je de
veroorzaker weet
o Vermindert
wateroplosbaarheid
o β-sheet bevorderende
aminozuren: “β-
branched aminozuren”
▪ Valine
▪ Isoleucine
▪ Threonine
Tertiaire structuur: 3D vouwing
Quaternaire structuur: wanneer eiwit bestaat uit meerdere peptideketens (subunits) die aggregeren tot één
eiwitcomplex
Aanpassingen eiwit Effect
pH verandering Verstoring elektrostatische interacties
Extrinsiek Denaturantia toevoegen Verstoring waterstofbruggen
Temperatuurschommelingen Verstoring waterstofbruggen
β-sheet breker: voorkomt neerslag van β-sheetgevoelige
Intrinsiek Insertie aminozuur proline
ketens → wateroplosbaarheid ↑
3 - 53
, Degradatie van eiwitten
Chemische instabiliteit
Proteolyse
- Afbraak door enzymen
- Trypsine: knipt na lysine en arginine
- Chymotrypsine: knipt na fenylalanine, tyrosine en tryptofaan
Hydrolyse
- Voor veel eiwitten pH > 8 desastreus
- Lage pH: water als H2O; slechte nucleofiel langzaam proces
- Hoge pH: water als OH ; goede nucleofiel
- sneller proces
o Deamidatie van zijketens asparagine en glutamine
▪ Risico na deamidatie → ringvorming
▪ Ringvorm: succinimidyl peptide
▪ Voorbeeld asparagine – glycine
• Kan op twee manieren opensplitsen
• Manier 1: ontstaan -COOH eindgroep en behoud
peptide backbone aspartyl peptide
o Introductie negatieve lading {-COO-}
• Manier 2: verplaatsing peptide backbone
isoaspartyl peptide
- Beïnvloedende factor: pH
3 Zure hydrolyse
5 Basische hydrolyse
4 Isomerisatie na deamidatie van asparagine
Deamidatie/isomerisatie
- Aminozuren met amide zijketen: asparagine, glutamine
o Deamidatie; amidegroep verdwijnt, uitwisseling voor
carboxylgroep; introductie van lading {-COO-}
- Asparagine – proline
o Combinatie valt spontaan uiteen bij zure pH
o Waar mogelijk sequentie voorkomen in therapeutische
eiwitten
- N-terminaal glutamine
o Wordt pyroglutamyl; basische zijketen
o Wordt amide; niet meer basisch
o Waar mogelijk asparagine op N-terminus als een
basisch uiteinde van belang is
- Beïnvloedende factor: pH (tussen pH 3 en 6 het minst)
4 - 53
