deel moleculaire diagnostiek - mevrouw vreys
het artikel: Differentiatie van Staphylococcus aureus en Staphylococcus
epidermidis door pCr voor het fibrinogeen bindend proteine gen.
vertaling ‘abstract’
Mastitis is een van de meest voorkomende en belastende ziekten die melkvee
teisteren. Naast andere oorzaken van mastitis, worden stafylokokken vaak
geassocieerd met klinische en subklinische mastitis.
Hoewel Staphylococcus aureus de belangrijkste betrokken soort is, worden
Staphylococcus epidermidis en andere coagulase-negatieve staphylococcen in
toenemende mate geisoleerd van rundermastitis.
Hoewel Staph. aureus en Staph. epidermidis gemakkelijk kunnen worden
onderscheiden op basis van hun biochemische eigenschappen, is zo'n fenotypische
identificatie tijdrovend en bewerkelijk. Deze studie had tot doel Staph. aureus en
Staph. epidermidis snel te identificeren. Daartoe werd een multiplex PCR ontwikkeld
en wij ontdekten we dat een enkel gen dat codeert voor het adhesine fibrinogeen
bindend eiwit kon worden gebruikt om de twee soorten te identificeren en te
onderscheiden. Bijgevolg werd een multiplex reactie waarbij een triplex PCR voor
Staph. aureus en een duplex PCR voor Staph. epidermidis werd gestandaardiseerd,
eerst met bacteriele culturen en vervolgens met gepasteuriseerde melk met levende
organismen of DNA geëxtraheerd de organismen.
De test kon specifiek Staph. aureus en Staph. epidermidis opsporen, zelfs in
aanwezigheid van andere organismen.
De test had een hoge diagnostische gevoeligheid en specificiteit. De toepassing van
van de test werd geverifieerd op 602 veldisolaten van stafylokokken die eerder waren
gekarakteriseerd met fenotypische methoden. Belangrijk is dat 25 coagulase-
negatieve isolaten door de multiplex PCR geidentificeerd als Staph. aureus. De test
kan worden aangepast voor gebruik in klinisch-diagnostische laboratoria
wat is het doel van het onderzoek? S. aureus en s. epidermidis snel te identificeren.
hoe gebeurde de onderscheiding? door multiplex PCR, een enkel gen dat codeert voor het
fibrinogeen bindend eiwit kon gebruikt worden om de twee soorten te identificeren en te
onderscheiden.
Boviene mastitis is een van de belangrijkste ziekten die de zuivelindustrie treft. Een
snelle diagnose van mastitis zijn cruciaal voor het opzetten van een geschikte
therapie en om mastitis onder controle te krijgen. Bacterien zijn verantwoordelijk voor
de meeste IMI. Tijdens mastitis leiden meerdere pathogenen, variabele uitscheiding,
remmers van zowel de gastheer als de microben, antibioticaresiduen, aanwezigheid
van ontstekingscellen, en het voortduren van ontsteking zelfs na de verwijdering van
bacterien tot een dynamische toestand van uierontsteking en -infectie. Deze en
andere factoren, zoals ongunstige omstandigheden tijdens het vervoer van monsters
en tijdens verrijking, incubatie of invriezen voor kweek, het volume van het inoculum
en de aanrijkingsomstandigheden, kunnen de isolatie en identificatie van bacterien
beinvloeden. Fenotyperingsmethoden zijn tijdrovend, weinig gevoelig, onvoldoende
1
lab klinische en moleculaire diagnostiek
,gestandaardiseerd tussen laboratoria, en niet zeer betrouwbaar. Van de bekende en
potentiele pathogenen dieverantwoordelijk zijn voor de meeste IMI, overheersen
slechts enkele soorten stafylokokken. Stafylokokken kunnen snel infecties
veroorzaken, en blijven vaak lang onopgemerkt vooral bij subklinische mastitis.
Fenotypische methoden blijven de gouden standaard voor de identificatie van
vertaling ‘introductie’
stafylokokken, en verschillende op kweek gebaseerde systemen zijn
gecommercialiseerd. In 30 tot 50% van de mastitisch melkmonsters vertonen echter
geen bacteriele groei onder conventionele kweekomstandigheden. Bovendien hebben
fenotypische methoden een gering discriminerend vermogen, omdat ze vaak soorten
verkeerd identificeren als gevolg van overlappende fenotypes.
Analyse op basis van polymerasekettingreacties heeft verschillende voordelen ten
opzichte van fenotypische methoden:
(1) directe detectie en identificatie zonder kweek
(2) snelle doorlooptijd
(3) hoge verwerkingscapaciteit
(4) grote nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid, gevoeligheid of specificiteit (5)
objectieve, gebruikersonafhankelijke interpretatie.
Enkelvoudige en multiplex PCR die gebruik maken van zowel end-point en real-time
methodologieën, alleen of in combinatie met andere technieken, zijn toegepast voor
de identificatie van stafylokokken tot op genus- en soortniveau voor het voorspellen
van het vermogen van de organismen om toxinen of virulentiedeterminanten tot
expressie te brengen of resistentie tegen antibiotica.
De isolatie van Staph. Aureus kwam vaker voor in individuele huishoudens en CNS
kwam vaker voor in een georganiseerde zuivelsector in een kleine regio in Zuid-India.
We redeneerden dat de pathobiologie van mastitis veroorzaakt door Staph. Aureus of
CNS verschillend zou kunnen zijn, en dat een snelle identificatie en differentiatie van
Staph. aureus en Staph.epidermidis zou kunnen helpen bij het ontwerpen van
differentiele interventiestrategieen. Tijdens bio-informatica analyses om PCR te
ontwikkelen voor gelijktijdige detectie van virulentie determinanten en differentiatie
van mastitis-geassocieerde Staph. aureus en Staph. epidermidis, vonden we dat het
gen dat codeert voor het fibrinogeen bindend eiwit, fib, de 2 soorten kan
onderscheiden. De ontwikkeling bleek in een enkele reactie van een multiplex PCR
assay voor gelijktijdige detectie en differentiatie van Staph. aureus en Staph.
epidermidis. De resultaten wijzen erop dat deze assays zouden kunnen worden
aangepast voor de opsporing van deze organismen in melk.
Voor routine PCR werd bacterieel genomisch DNA geextraheerd uit een nachtkweek
vertaling
van ‘extractie
een kolonie metvan dna, primers
behulp van eenenDNA
pcr isolatiekit.
condities’
Voor detectiegrens experimenten werd 1 mL van de nachtkweek gebruikt
zonder verdunning of serieel 10-voudig verdund tot 1 mL in PBS.
Genomisch DNA werd bereid door de cultuur of het verdunde monster in kokend
water gedurende 10 min, oogsten supernatans, en het extraheren van het DNA.
Voor experimenten zonder of met verrijking, worden bekende kolonievormende
eenheden bacterien geinoculeerd in melk en DNA werd geextraheerd na
overnacht incubatie bij 37°C.
2
lab klinische en moleculaire diagnostiek
, de pcr werd als volgt uitgevoerd:
1) eerste denaturatiestap van 5 minuten bij 94°C, gevolgd door 30 cycli van 30 s.
2) denaturatie bij 94°C.
3) 30 s annealing bij 60°C.
4) 1 min verlenging bij 72°C.
5) laatste verlenging van 10 min bij 72°C.
De specificiteit van elk primerpaar werd geverifieerd door toetsing aan het DNA van
standaard stammen. Multiplex PCR werd gestandaardiseerd door het varieren van de
combinatie van primerparen, de annealingtemperatuur en de concentraties van
primers, deoxynucleotide trifosfaten en enzymen.
gebruikte primers
primers lengte (bp)
23S rRna 1250
fnbp
sa-fib 210
nuc
vertaling ‘resultaten’ 441
se-fib 720
se-124 124
eubac
Bij het vergelijken van 15 Staph. aureus en 2 Staph. epidermidis, identificeerden we
korte stukken binnen de sequenties van fib om de twee soorten te kunnen
onderscheiden. Primers voor zowel de soorten als voor verschillende lengtes van
fibrinogeen bindend eiwit (FnBp) en nuc- fragmenten werden ontworpen met het oog
op multiplexing. De initiele amplificatie van de afzonderlijke fragmenten werd
gestandaardiseerd met behulp van referentiestammen. Fragmenten van 23S rRNA
(1.250 bp), nuc (441 bp), en Sa-fib (200 bp) werden waargenomen met Staph. aureus-
sjablonen, terwijl fragmenten van Se-fib (700 bp) en Se-124 (124 bp) geproduceerd
werden uit Staph. epidermidis sjablonen. Elk amplicon werd geverifieerd door
nucleotide-sequencing. Combinaties van primerparen bevestigden ook de amplificatie
van 23S rRNA, nuc, en Sa-fib van Staph. aureus- sjablonen, en Se-fib en Se-124 van
Staph. Epidermis.
1) 23S RRNA
2) nuc
3) sa-fib
4) Se-fib
5) Se-124
M) dna ladder
6) multiplex pcr van S. aureus met 23S rRNA,
3
lab klinische en moleculaire diagnostiek
het artikel: Differentiatie van Staphylococcus aureus en Staphylococcus
epidermidis door pCr voor het fibrinogeen bindend proteine gen.
vertaling ‘abstract’
Mastitis is een van de meest voorkomende en belastende ziekten die melkvee
teisteren. Naast andere oorzaken van mastitis, worden stafylokokken vaak
geassocieerd met klinische en subklinische mastitis.
Hoewel Staphylococcus aureus de belangrijkste betrokken soort is, worden
Staphylococcus epidermidis en andere coagulase-negatieve staphylococcen in
toenemende mate geisoleerd van rundermastitis.
Hoewel Staph. aureus en Staph. epidermidis gemakkelijk kunnen worden
onderscheiden op basis van hun biochemische eigenschappen, is zo'n fenotypische
identificatie tijdrovend en bewerkelijk. Deze studie had tot doel Staph. aureus en
Staph. epidermidis snel te identificeren. Daartoe werd een multiplex PCR ontwikkeld
en wij ontdekten we dat een enkel gen dat codeert voor het adhesine fibrinogeen
bindend eiwit kon worden gebruikt om de twee soorten te identificeren en te
onderscheiden. Bijgevolg werd een multiplex reactie waarbij een triplex PCR voor
Staph. aureus en een duplex PCR voor Staph. epidermidis werd gestandaardiseerd,
eerst met bacteriele culturen en vervolgens met gepasteuriseerde melk met levende
organismen of DNA geëxtraheerd de organismen.
De test kon specifiek Staph. aureus en Staph. epidermidis opsporen, zelfs in
aanwezigheid van andere organismen.
De test had een hoge diagnostische gevoeligheid en specificiteit. De toepassing van
van de test werd geverifieerd op 602 veldisolaten van stafylokokken die eerder waren
gekarakteriseerd met fenotypische methoden. Belangrijk is dat 25 coagulase-
negatieve isolaten door de multiplex PCR geidentificeerd als Staph. aureus. De test
kan worden aangepast voor gebruik in klinisch-diagnostische laboratoria
wat is het doel van het onderzoek? S. aureus en s. epidermidis snel te identificeren.
hoe gebeurde de onderscheiding? door multiplex PCR, een enkel gen dat codeert voor het
fibrinogeen bindend eiwit kon gebruikt worden om de twee soorten te identificeren en te
onderscheiden.
Boviene mastitis is een van de belangrijkste ziekten die de zuivelindustrie treft. Een
snelle diagnose van mastitis zijn cruciaal voor het opzetten van een geschikte
therapie en om mastitis onder controle te krijgen. Bacterien zijn verantwoordelijk voor
de meeste IMI. Tijdens mastitis leiden meerdere pathogenen, variabele uitscheiding,
remmers van zowel de gastheer als de microben, antibioticaresiduen, aanwezigheid
van ontstekingscellen, en het voortduren van ontsteking zelfs na de verwijdering van
bacterien tot een dynamische toestand van uierontsteking en -infectie. Deze en
andere factoren, zoals ongunstige omstandigheden tijdens het vervoer van monsters
en tijdens verrijking, incubatie of invriezen voor kweek, het volume van het inoculum
en de aanrijkingsomstandigheden, kunnen de isolatie en identificatie van bacterien
beinvloeden. Fenotyperingsmethoden zijn tijdrovend, weinig gevoelig, onvoldoende
1
lab klinische en moleculaire diagnostiek
,gestandaardiseerd tussen laboratoria, en niet zeer betrouwbaar. Van de bekende en
potentiele pathogenen dieverantwoordelijk zijn voor de meeste IMI, overheersen
slechts enkele soorten stafylokokken. Stafylokokken kunnen snel infecties
veroorzaken, en blijven vaak lang onopgemerkt vooral bij subklinische mastitis.
Fenotypische methoden blijven de gouden standaard voor de identificatie van
vertaling ‘introductie’
stafylokokken, en verschillende op kweek gebaseerde systemen zijn
gecommercialiseerd. In 30 tot 50% van de mastitisch melkmonsters vertonen echter
geen bacteriele groei onder conventionele kweekomstandigheden. Bovendien hebben
fenotypische methoden een gering discriminerend vermogen, omdat ze vaak soorten
verkeerd identificeren als gevolg van overlappende fenotypes.
Analyse op basis van polymerasekettingreacties heeft verschillende voordelen ten
opzichte van fenotypische methoden:
(1) directe detectie en identificatie zonder kweek
(2) snelle doorlooptijd
(3) hoge verwerkingscapaciteit
(4) grote nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid, gevoeligheid of specificiteit (5)
objectieve, gebruikersonafhankelijke interpretatie.
Enkelvoudige en multiplex PCR die gebruik maken van zowel end-point en real-time
methodologieën, alleen of in combinatie met andere technieken, zijn toegepast voor
de identificatie van stafylokokken tot op genus- en soortniveau voor het voorspellen
van het vermogen van de organismen om toxinen of virulentiedeterminanten tot
expressie te brengen of resistentie tegen antibiotica.
De isolatie van Staph. Aureus kwam vaker voor in individuele huishoudens en CNS
kwam vaker voor in een georganiseerde zuivelsector in een kleine regio in Zuid-India.
We redeneerden dat de pathobiologie van mastitis veroorzaakt door Staph. Aureus of
CNS verschillend zou kunnen zijn, en dat een snelle identificatie en differentiatie van
Staph. aureus en Staph.epidermidis zou kunnen helpen bij het ontwerpen van
differentiele interventiestrategieen. Tijdens bio-informatica analyses om PCR te
ontwikkelen voor gelijktijdige detectie van virulentie determinanten en differentiatie
van mastitis-geassocieerde Staph. aureus en Staph. epidermidis, vonden we dat het
gen dat codeert voor het fibrinogeen bindend eiwit, fib, de 2 soorten kan
onderscheiden. De ontwikkeling bleek in een enkele reactie van een multiplex PCR
assay voor gelijktijdige detectie en differentiatie van Staph. aureus en Staph.
epidermidis. De resultaten wijzen erop dat deze assays zouden kunnen worden
aangepast voor de opsporing van deze organismen in melk.
Voor routine PCR werd bacterieel genomisch DNA geextraheerd uit een nachtkweek
vertaling
van ‘extractie
een kolonie metvan dna, primers
behulp van eenenDNA
pcr isolatiekit.
condities’
Voor detectiegrens experimenten werd 1 mL van de nachtkweek gebruikt
zonder verdunning of serieel 10-voudig verdund tot 1 mL in PBS.
Genomisch DNA werd bereid door de cultuur of het verdunde monster in kokend
water gedurende 10 min, oogsten supernatans, en het extraheren van het DNA.
Voor experimenten zonder of met verrijking, worden bekende kolonievormende
eenheden bacterien geinoculeerd in melk en DNA werd geextraheerd na
overnacht incubatie bij 37°C.
2
lab klinische en moleculaire diagnostiek
, de pcr werd als volgt uitgevoerd:
1) eerste denaturatiestap van 5 minuten bij 94°C, gevolgd door 30 cycli van 30 s.
2) denaturatie bij 94°C.
3) 30 s annealing bij 60°C.
4) 1 min verlenging bij 72°C.
5) laatste verlenging van 10 min bij 72°C.
De specificiteit van elk primerpaar werd geverifieerd door toetsing aan het DNA van
standaard stammen. Multiplex PCR werd gestandaardiseerd door het varieren van de
combinatie van primerparen, de annealingtemperatuur en de concentraties van
primers, deoxynucleotide trifosfaten en enzymen.
gebruikte primers
primers lengte (bp)
23S rRna 1250
fnbp
sa-fib 210
nuc
vertaling ‘resultaten’ 441
se-fib 720
se-124 124
eubac
Bij het vergelijken van 15 Staph. aureus en 2 Staph. epidermidis, identificeerden we
korte stukken binnen de sequenties van fib om de twee soorten te kunnen
onderscheiden. Primers voor zowel de soorten als voor verschillende lengtes van
fibrinogeen bindend eiwit (FnBp) en nuc- fragmenten werden ontworpen met het oog
op multiplexing. De initiele amplificatie van de afzonderlijke fragmenten werd
gestandaardiseerd met behulp van referentiestammen. Fragmenten van 23S rRNA
(1.250 bp), nuc (441 bp), en Sa-fib (200 bp) werden waargenomen met Staph. aureus-
sjablonen, terwijl fragmenten van Se-fib (700 bp) en Se-124 (124 bp) geproduceerd
werden uit Staph. epidermidis sjablonen. Elk amplicon werd geverifieerd door
nucleotide-sequencing. Combinaties van primerparen bevestigden ook de amplificatie
van 23S rRNA, nuc, en Sa-fib van Staph. aureus- sjablonen, en Se-fib en Se-124 van
Staph. Epidermis.
1) 23S RRNA
2) nuc
3) sa-fib
4) Se-fib
5) Se-124
M) dna ladder
6) multiplex pcr van S. aureus met 23S rRNA,
3
lab klinische en moleculaire diagnostiek
