Samenvatting: Automatisatie
Hoofdstuk 1: Automatisatie in de Hematologie
Hematologie-analyser of celteller:
Sysmex-XN (inclusief uitstrijkapparaat en kleurtoestel)
Volautomatisch
Tellen van RBC, WBC en bloedplaatjes
Hb, MVC, HCT, MCH en MCHC
WBC-differentiatie
Reticulocyten (jongste RBC)
Technologie:
1. Hemoglobine: fotometrie (cyanide-free Sodium Lauryl
Sulfate) = een niet toxisch reagens en deel uitmakend
van een zeep (vorming stabiel product)
Lipemie: kan interfereren met de klassieke
hemoglobine-meting
Erythrocyten worden gelyseerd in een 1:500
verdunning.
1. Reactie stap:
Hemoglobine met het gebonden Fe2+ wordt geoxideerd door kalium
hexocyanoferraat (K3(Fe(CN)6 ) naar methemoglobine (bevat Fe3+).
2. Reactie stap:
Methemoglobine reageert met kaliumcyanide (KCN) en vormt een rood en stabiel
cyaan-hemoglobine-complex, wat een absorptie maximum heeft bij 546 nm.
Extinctie van het absorptie maximum staat in rechtstreekse verhouding tot de
hemoglobine concentratie van het bloed.
2. RBC, PLT, HCT: impedantie
Coutler principe = verandering van weerstand tussen
elektroden wanneer een niet-geleidend partikel doorheen
een opening tussen de elektroden passeert
Cellen passeren 1 voor 1 door een kleine opening
Passage van 1 cel: verandering in de weerstand (impedantie)
pulsehoogte ~ grootte van de cel
Hoe groter de weerstandverandering, hoe groter de cellen
, Een bekend volume staal wordt opgezogen:
aantal geregistreerde signalen is een maat voor de concentratie cellen
in de suspensie.
hoogte van het signaal = maat voor het volume van de cel
Hydrodynamische focusering:
Verdund staal – omgeven door sheath reagens - wordt geduwd door een
meetopening
De bloedcellen passeren doorheen de meetopening cel per cel omgeven door het
sheath reagens en gecentreerd in het midden van de opening.
Recirculatie fenomeen:
= fenomeen waarbij cellen die reeds de opening hebben gepasseerd, opnieuw even
voorbij de opening passeren en een bijhorende signaal genereren.
Dit fenomeen kan de oorzaak zijn van valse impulsen die kunnen interfereren bij de
telling van de bloedplaatjes.
Pyrolyse:
Na iedere cyclus passeert een elektrische stroom door de meetopeningen van de
baden (voorkomt stolsels en afzettingen) Het aantal pulsen komt overeen met het
aantal cellen die de micro-opening hebben gepasseerd.
Absolute Meting Relatieve Meting
• Meting van deeltjes in een • Meting van deeltjes per
welbepaald volume. tijdseenheid.
• Cel concentratie wordt • Gebaseerd op een
gemeten in relatie tot een referentiestaal, dus de
gekend staalvolume met een telling wordt indirect
gedefinieerde dilutie. gemeten.
-> Geen calibratie van celtelling -> calibratie noodzakelijk
is vereist. COULTER-LH
SYSMEX-XN
MCV (gemiddeld bloedvolume) 85-94 fl
MCH (verhouding Hgb op RBC) 28-32 pg
MCHC (verhouding Hgb op hematocriet) 32-35 g/dL
Abnormaal bloedbeeld:
Abnormale distributie wegens interferenties van micro RBC of fragmentocyten in PLT
kanaal. Problemen met fragmentocyten, microcyten, reuzetrombocyten en
bloedplaatjesagglutinaten.
Oplossing: PLT-F kanaal (zie verder)
,3. WBC, reticulocyten: Fluorescence Flow Cytometrie (FSC, SSC en SFL)
Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) = Forward Scatter
Zijwaartse lichtverstrooiing (SSC) = Side Scatter
Zijwaartse fluorescentie (SFL) = Side Fluorescence
FSC Indicatie over grootte van de cel
SSC Inhoud over celinhoud/grootte van de kern
SFL Info over DNA en RNA inhoud (kleuring polymethine)
Hydrodynamische focusering:
1. staalinbreng
2. geleidingsvloeistof (sheat flow) voor goede focusering
3. gecentreerde celstroom
4. laserlicht
5. lichtverstrooiing (FSC en SSC)
Waarom fluorescentie?
Polymethine (en oxazine) kleurt DNA en RNA
Verschaft info over: Cel-Activiteit (Delingsvermogen van de kern DNA
omhoog en Cytoplasma-Activiteit (Eiwitsynthese RNA omhoog)
Bijkomende info over de kern en cytoplasma-activiteit van de cel
, WNR-kanaal (FSC/SFL):
Klassieke perifeer bloedbeeld
WNR = white nucleated redbloodcells
Horizontale as SFL
Verticale as FSC
Het WNR-kanaal telt de witte bloedcellen en voert een differentiële telling uit van
basofielen en NRBC’s.
Lyse van RBC en plaatjes + lichte lyse van de WBC waardoor de membranen
doorlaatbaar worden (reagens: Lysercell WNR)
◦ Basofielen zijn meer lyseresistent (groter volume door minder
volumekrimping)
Kleuring met Fluorocell WNR (polymethine 0,005%): aankleuren van RNA en DNA
Reacties:
1. Lysercell WNR:
Hemolyse RBC+ penetratie van de
WBC → veranderingen in vorm en
grootte
2. Fluorocell WNR:
Kleuring van de celorganellen en
nucleïnezuren
Hoofdstuk 1: Automatisatie in de Hematologie
Hematologie-analyser of celteller:
Sysmex-XN (inclusief uitstrijkapparaat en kleurtoestel)
Volautomatisch
Tellen van RBC, WBC en bloedplaatjes
Hb, MVC, HCT, MCH en MCHC
WBC-differentiatie
Reticulocyten (jongste RBC)
Technologie:
1. Hemoglobine: fotometrie (cyanide-free Sodium Lauryl
Sulfate) = een niet toxisch reagens en deel uitmakend
van een zeep (vorming stabiel product)
Lipemie: kan interfereren met de klassieke
hemoglobine-meting
Erythrocyten worden gelyseerd in een 1:500
verdunning.
1. Reactie stap:
Hemoglobine met het gebonden Fe2+ wordt geoxideerd door kalium
hexocyanoferraat (K3(Fe(CN)6 ) naar methemoglobine (bevat Fe3+).
2. Reactie stap:
Methemoglobine reageert met kaliumcyanide (KCN) en vormt een rood en stabiel
cyaan-hemoglobine-complex, wat een absorptie maximum heeft bij 546 nm.
Extinctie van het absorptie maximum staat in rechtstreekse verhouding tot de
hemoglobine concentratie van het bloed.
2. RBC, PLT, HCT: impedantie
Coutler principe = verandering van weerstand tussen
elektroden wanneer een niet-geleidend partikel doorheen
een opening tussen de elektroden passeert
Cellen passeren 1 voor 1 door een kleine opening
Passage van 1 cel: verandering in de weerstand (impedantie)
pulsehoogte ~ grootte van de cel
Hoe groter de weerstandverandering, hoe groter de cellen
, Een bekend volume staal wordt opgezogen:
aantal geregistreerde signalen is een maat voor de concentratie cellen
in de suspensie.
hoogte van het signaal = maat voor het volume van de cel
Hydrodynamische focusering:
Verdund staal – omgeven door sheath reagens - wordt geduwd door een
meetopening
De bloedcellen passeren doorheen de meetopening cel per cel omgeven door het
sheath reagens en gecentreerd in het midden van de opening.
Recirculatie fenomeen:
= fenomeen waarbij cellen die reeds de opening hebben gepasseerd, opnieuw even
voorbij de opening passeren en een bijhorende signaal genereren.
Dit fenomeen kan de oorzaak zijn van valse impulsen die kunnen interfereren bij de
telling van de bloedplaatjes.
Pyrolyse:
Na iedere cyclus passeert een elektrische stroom door de meetopeningen van de
baden (voorkomt stolsels en afzettingen) Het aantal pulsen komt overeen met het
aantal cellen die de micro-opening hebben gepasseerd.
Absolute Meting Relatieve Meting
• Meting van deeltjes in een • Meting van deeltjes per
welbepaald volume. tijdseenheid.
• Cel concentratie wordt • Gebaseerd op een
gemeten in relatie tot een referentiestaal, dus de
gekend staalvolume met een telling wordt indirect
gedefinieerde dilutie. gemeten.
-> Geen calibratie van celtelling -> calibratie noodzakelijk
is vereist. COULTER-LH
SYSMEX-XN
MCV (gemiddeld bloedvolume) 85-94 fl
MCH (verhouding Hgb op RBC) 28-32 pg
MCHC (verhouding Hgb op hematocriet) 32-35 g/dL
Abnormaal bloedbeeld:
Abnormale distributie wegens interferenties van micro RBC of fragmentocyten in PLT
kanaal. Problemen met fragmentocyten, microcyten, reuzetrombocyten en
bloedplaatjesagglutinaten.
Oplossing: PLT-F kanaal (zie verder)
,3. WBC, reticulocyten: Fluorescence Flow Cytometrie (FSC, SSC en SFL)
Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) = Forward Scatter
Zijwaartse lichtverstrooiing (SSC) = Side Scatter
Zijwaartse fluorescentie (SFL) = Side Fluorescence
FSC Indicatie over grootte van de cel
SSC Inhoud over celinhoud/grootte van de kern
SFL Info over DNA en RNA inhoud (kleuring polymethine)
Hydrodynamische focusering:
1. staalinbreng
2. geleidingsvloeistof (sheat flow) voor goede focusering
3. gecentreerde celstroom
4. laserlicht
5. lichtverstrooiing (FSC en SSC)
Waarom fluorescentie?
Polymethine (en oxazine) kleurt DNA en RNA
Verschaft info over: Cel-Activiteit (Delingsvermogen van de kern DNA
omhoog en Cytoplasma-Activiteit (Eiwitsynthese RNA omhoog)
Bijkomende info over de kern en cytoplasma-activiteit van de cel
, WNR-kanaal (FSC/SFL):
Klassieke perifeer bloedbeeld
WNR = white nucleated redbloodcells
Horizontale as SFL
Verticale as FSC
Het WNR-kanaal telt de witte bloedcellen en voert een differentiële telling uit van
basofielen en NRBC’s.
Lyse van RBC en plaatjes + lichte lyse van de WBC waardoor de membranen
doorlaatbaar worden (reagens: Lysercell WNR)
◦ Basofielen zijn meer lyseresistent (groter volume door minder
volumekrimping)
Kleuring met Fluorocell WNR (polymethine 0,005%): aankleuren van RNA en DNA
Reacties:
1. Lysercell WNR:
Hemolyse RBC+ penetratie van de
WBC → veranderingen in vorm en
grootte
2. Fluorocell WNR:
Kleuring van de celorganellen en
nucleïnezuren
