Methoden in het biofarmaceutisch onderzoek: instrumentele analyse (5SP)
H1: BASISBEGRIPPEN I.V.M. SCHEIDINGSTECHNIEKEN
- ontdekker chromatografie: Michael Tswett
- verschillende vormen: vloeistof/gas, zuil/planair, analytisch/preparatief en kwalitatief/kwantitatief
- retentie = weerhouden worden van stoffen door stat. fase, retentietijd (tR) = tijd die stof nodig heeft om detector te bereiken
- verdelingscoëfficiënt: K = Cs/Cm (als K groot -> migratiesnelheid klein)
- t0 = dood volume
- symmetrie factor: S = 0,05W/2d (W = piekbreedte) --> S < 1: staartvorming // S = 1: symmetrisch // S > 1: fronting
1,18(𝑡𝑅𝐵 − 𝑡𝑅𝐴 )
- resolutie: Rs = = maat voor scheiding tussen twee verbindingen --> Rs > 1,5: basislijnscheiding
0,5𝑊𝐴 + 0,5𝑊𝐵
𝑘′𝐵 tR −t0
- scheidingsfactor/selectiviteit: 𝛼 = [met k ′ = = vertraging] = verschil aan retentiegedrag tussen twee verbindingen
𝑘′𝐴 t0
𝑡𝑅 2
- efficiëntie -> theoretisch schotelgetal: 𝑁𝑡ℎ = 5,54 ( )
0,5𝑊
- HETP = L/N (height equivalent to a theoretical plate)
B
- Deemter vergelijking: H = A + u̅ + Cu̅
[H: HETP -> best zo klein mogelijk
A: Eddy diffusie -> constante, afhankelijk van partikeldiameter en vulling,
B: longitudinale diffusie -> afhankelijk van u̅,
C: weerstand tegen massatransport (uitwisseling)
en u̅: lineaire gassnelheid]
1 𝛼−1 𝑘′
- resolutievergelijking: 𝑅𝑠 = [ ][ ] √𝑁𝑡ℎ
4 𝛼 1+𝑘 ′
(zie figuren p. 13!!)
H2: GASCHROMATOGRAFIE
(schema gaschromatograaf zie p. 15)
GLC (gas-liquid): vloeibare stationaire fase <-> GSC (gas-solid): vaste stationaire fase
2.1 DRAAGGAS
- keuze bepaald door: chemische eigenschappen (Moet inert zijn!), prijs en aard van detector
- vrij van zuurstof -> oxidatie vermijden en van water -> hydrolyse vermijden
- veel gebruikt: Helium, Waterstof, Stikstof en Argon
2.2 INJECTOR
1. directe injector: (1-10μl) verdampt monster (50°C warmer dan kolom) -> monster meegesleurd door draaggas
2. splitinjector: (cap.) verdampt monster -> deel monster verloren door splitopening, rest meegesleurd door draaggas
3. splitless injecie: splitopening initieel dicht en kolom koud -> openen/verwarmen: solvent weggeblazen (toep. sporenanalyse)
4. on-column injectie: (cap.) kleine hoeveelheid vloeistof rechtstreeks op kolom aangebracht
5. statische headspace injectie: monster met oplosmiddel in flesje in verwarm waterbad -> evenwichtsinstelling -> deel
gasvormige ‘headspace’ geïnjecteerd in chromatograaf (toep. onderzoek residuele solventen, ethanol in bloed, afvalwater…)
*Wet van Henry: P = HX -> partiële gasdruk is evenredig aan molfractie in oplossing*
6. dynamische headspace injectie/’purge and trap analysis’: helium borrelt door flesje -> vluchtige stoffen meegesleurd op
adsorberende kolom en daar vastgelegd -> verwarmen: stoffen verder naar GC toestel (toep. grondmonster analyseren)
2.3 KOLOM (voorbeelden p. 25-26)
1. gepakte kolom: - materiaal: roestvrij staal/pyrex
- grootte: 1-3m lange spiraal, d = 0,125-6mm
- stationaire fase: partikels (d = 150-250μm) -> bv. diatomeenaarde
-> voorbehandeling: NAW, AW, AW-DMCS (silanolgroepen maskeren)
2. capillaire kolom: - materiaal: metaal of gesmolten kwarts (‘fused silica’)
- grootte: 5-100m lang patroon, d = 0,1 – 0,53mm
- stationaire fase geadsobeerd als film op binnenwand kolom
- WCOT (wall coated open tubular): vloeibare-/PLOT (porous layer open tubular): vaste stationaire fase
- stationaire fase: hoogkokende vloeistof (polymeer), lage viscositeit, inert en bedekkingsgraad 3-5%
- MAOT (max. allowable operating temperature): indien hier boven gegaan wordt kan bleeding optreden
- K = affiniteit voor stationaire fase (bep. door interacties verbinding-SF) = affiniteit voor mobiele fase (bep. door dampspanning)
- retentie maximaal indien polair + polair of apolair + apolair (voorbeelden p. 29-30)
-> selectiviteit van kolom komt overeen met polariteit
-> polaire kolommen: scheiding o.b.v. polariteit (H-bruggen)
-> apolaire kolommen: scheiding o.b.v. kookpunt
- kolomoven: isotherm -> tijdverspilling op het einde -> temperatuurprogramma (hoe hoger temperatuur, hoe sneller scheiding)
1
, 2.4 DETECTOREN (samenvatting p. 39)
(ruis: schommelingen door interferentie -> spikes: verwaarloosbare pieken, wander↗ en drift↘: sprongen in basislijn)
1. vlamionisatie detector (FID): vlam (H2 + O2) -> verbrandt alle stoffen -> ionen -> e-/stroom -> meet elektrische geleidbaarheid
-> signaal voor alle organische stoffen
2. katarometer (TCD): meet ∆Rweerstanddraad t.g.v. ∆T
3. electron capture detector (ECD): radioactieve bron ioniseert draaggas -> e- vrij -> stof vangt e- -> meet verlaging geleidbaarheid
-> signaal voor stoffen die elektronen kunnen vangen -> E.N. stoffen, bv. halogenen (meer selectief en gevoeliger)
4. vlamfotometrische detector (FPD): vlam -> licht uitgezonden -> door filters -> fotomultiplicatorbuis: licht -> stroom (gemeten)
-> specifiek voor zwavel, fosfor (en halogeenverbindingen)
5. stikstof-fosfor- (NPD)/ thermo-ionisatie detector (TID): selectieve FID o.w.v. verhitting rubidiumzout en lager debiet
6. massaspectrometer (GC-MS): ionen scheiden o.b.v. massa-ladingsverhouding (m/z)
-> meest ideale GC-detector o.w.v. hoge selectiviteit(gekoppelde techniek = hyphenation) (opstelling p. 40)
2.5 DERIVATISERING (overzicht p. 41!!!)
-> vluchtigheid, resolutie en gevoeligheid detectie nemen toe en staartvorming kan vermeden worden
-> silyleringsmiddelen: p. 42-43!!
2.6 TOEPASSINGEN (zie p. 44-50!!!)
- kwalitatieve analyse: o.b.v. (relatieve) retentietijd
- kwantitatieve analyse: zie BOT II
H3: DUNNELAAGCHROMATOGRAFIE (DLC/TLC)
Rf = (retardation-/retentie factor/) ratio to the front
3.1 ADSORPTIE ALS VERTRAGINGSMECHANISME (voor weinig of matig polaire stoffen)
- verzadigingsfenomeen: absorptieplaatsen gradueel gevuld -> bereiken plateauwaarde
- hogere temperatuur -> moleculen bewegen sneller -> minder steile curve en plateau sneller bereikt
- gekromde absorptie-isothermen: adsorptieplaatsen met lage en hoge affiniteit -> knik in curve (mog. verklaring: staartvorming)
- vereenvoudigd model TLC: adsorbens (vaste fase) (vaak silicagel) + solventmoleculen (mobiele fase) (S) + moleculen opgeloste stof (X)
εo = adsorptie-energie per opp.-eenheid voor bepaald adsorptiemateriaal -> affiniteit van S voor adsorbens
Eo = adsorptie-energie per opp.-eenheid voor bepaald adsorptiemateriaal -> affiniteit van X voor adsorbens
--> als εo << Eo dan zal er meer retentie optreden en omgekeerd als εo >> Eo dan zal er minder retentie optreden
--> de εo van een mengsel van solventen kan niet worden bepaald door optelling rekening houdend met hun verhouding
- absorbens = silicagel: kenmerken: witte stof, korrelgrootte 5-10µm en bevat silanolgroepen (licht zure eig.)
silanolgroepen: geïsoleerde- > H-gebonden- > gehydrateerde- > als siloxaan groep
--> activering door verwarmen bij: 100°C (geadsorbeerd water weg) of 400°C (water weg, maar -Si-O- i.p.v. ≡SiOH)
--> interacties: dipool-dipool, H-bruggen en zuur-base (zwak zure silanolen + basen)
- solventspecificiteit: ook interacties in mobiele fase tussen de te scheiden stoffen X en Y en solventmoleculen S
EoX < EoY: scheiding X en Y | EoX = EoY: geen scheiding X en Y | EoX = EoY + solventspecificiteit (interactie Y-S -> rententie Y↘): wel scheiding X en Y
3.2 NORMALE VERDELINGS ALS VERTRAGINGSMECHANISME
- dragermaterialen: o cellulosepoeder: natuurlijke cellulose behandeld met zuur zodat amorfe delen deels verwijderd zijn
o kiezelguhr (diatomeeënaarde): van kiezelwieren, vgl. met silicagel maar minder silanolgroepen
o silicagel: loopmiddel moet aangepast zijn zodat silanolgroepen grotendeels gemaskeerd zijn
- stationaire fasen: voor celluloseplaten -> ontmenging van loopvloeistof aan celluloselaag
voor kiezelguhr -> vooraf drenken in polaire stat. fase (bv. formamide), laten drogen en optrekken met organisch solvent
- bv. 2D TLC van aminozuren (p. 58-60): eerst horizontaal behandelen met zuur loopsysteem, nadien verticaal met basisch-
-> kleurreactie met ninhydrine: 1°AZ paars gekleurd, 2°AZ licht gekleurd en 3°AZ geen kleur
-> systeem I (zuur): effect basische polaire groep meer uitgesproken o.w.v. protonering (NH3+)
systeem II (basisch): effect zure polaire groepen meer uitgesproken o.w.v. ionisatie (COO-)
3.3 OMGEKEERDE FASE VERDELINGSCHROMATOGRAFIE (stationaire fase meer apolair dan mobiele fase!)
- silicagel/kiezelguhr als drager: stationaire fase = paraffine/undecaan
loopvloeistof = HoAc-CH3CN (voor silicaplaten) en Me2COCH3CN (voor kiezelguhr platen)
- chemisch gemodificeerde silicagel: gesilaneerde- (bv. scheiding vetzuren) en gebonden C8/C18 fase (bv. scheiding ftalaten)
3.4 APPARATUUR EN UITVOERING
1. dunnelaagplaat: a. silicagel G (met gips in calciumsulfaat binder) c. silicagel met fluorescentie-indicator (F/UV254)
b. silicagel H (zonder gips) d. HPTLC: high performance (betere kwaliteit)
2. monster aanbrengen: niet te hoge concentratie, microspuit i.g.v. kwantitatief werk, hoeveelheid afhankelijk van detectiegrens
keuze oplosmiddel: monster moet volledig oplossen, kookpunt niet te hoog en bij voorkeur apolair
diameter startvlek zo klein mogelijk en aanbrengen op 2cm van onderste rand
3. ontwikkelen van de plaat: in verzadigde/onverzadigde ontwikkelkamer
vlekken zichtbaar maken: fluorescentie (UV), absorbantie (UV), I2-dampen, verkolen, besproeien met specifiek reagens of densitometrie (p. 63)
4. berekenen van Rf: Rf = d/l (d = afstand die stof heeft afgelegd vanaf startplaats en l = afstand die solvent heeft afgelegd van start tot solventfront)
2
H1: BASISBEGRIPPEN I.V.M. SCHEIDINGSTECHNIEKEN
- ontdekker chromatografie: Michael Tswett
- verschillende vormen: vloeistof/gas, zuil/planair, analytisch/preparatief en kwalitatief/kwantitatief
- retentie = weerhouden worden van stoffen door stat. fase, retentietijd (tR) = tijd die stof nodig heeft om detector te bereiken
- verdelingscoëfficiënt: K = Cs/Cm (als K groot -> migratiesnelheid klein)
- t0 = dood volume
- symmetrie factor: S = 0,05W/2d (W = piekbreedte) --> S < 1: staartvorming // S = 1: symmetrisch // S > 1: fronting
1,18(𝑡𝑅𝐵 − 𝑡𝑅𝐴 )
- resolutie: Rs = = maat voor scheiding tussen twee verbindingen --> Rs > 1,5: basislijnscheiding
0,5𝑊𝐴 + 0,5𝑊𝐵
𝑘′𝐵 tR −t0
- scheidingsfactor/selectiviteit: 𝛼 = [met k ′ = = vertraging] = verschil aan retentiegedrag tussen twee verbindingen
𝑘′𝐴 t0
𝑡𝑅 2
- efficiëntie -> theoretisch schotelgetal: 𝑁𝑡ℎ = 5,54 ( )
0,5𝑊
- HETP = L/N (height equivalent to a theoretical plate)
B
- Deemter vergelijking: H = A + u̅ + Cu̅
[H: HETP -> best zo klein mogelijk
A: Eddy diffusie -> constante, afhankelijk van partikeldiameter en vulling,
B: longitudinale diffusie -> afhankelijk van u̅,
C: weerstand tegen massatransport (uitwisseling)
en u̅: lineaire gassnelheid]
1 𝛼−1 𝑘′
- resolutievergelijking: 𝑅𝑠 = [ ][ ] √𝑁𝑡ℎ
4 𝛼 1+𝑘 ′
(zie figuren p. 13!!)
H2: GASCHROMATOGRAFIE
(schema gaschromatograaf zie p. 15)
GLC (gas-liquid): vloeibare stationaire fase <-> GSC (gas-solid): vaste stationaire fase
2.1 DRAAGGAS
- keuze bepaald door: chemische eigenschappen (Moet inert zijn!), prijs en aard van detector
- vrij van zuurstof -> oxidatie vermijden en van water -> hydrolyse vermijden
- veel gebruikt: Helium, Waterstof, Stikstof en Argon
2.2 INJECTOR
1. directe injector: (1-10μl) verdampt monster (50°C warmer dan kolom) -> monster meegesleurd door draaggas
2. splitinjector: (cap.) verdampt monster -> deel monster verloren door splitopening, rest meegesleurd door draaggas
3. splitless injecie: splitopening initieel dicht en kolom koud -> openen/verwarmen: solvent weggeblazen (toep. sporenanalyse)
4. on-column injectie: (cap.) kleine hoeveelheid vloeistof rechtstreeks op kolom aangebracht
5. statische headspace injectie: monster met oplosmiddel in flesje in verwarm waterbad -> evenwichtsinstelling -> deel
gasvormige ‘headspace’ geïnjecteerd in chromatograaf (toep. onderzoek residuele solventen, ethanol in bloed, afvalwater…)
*Wet van Henry: P = HX -> partiële gasdruk is evenredig aan molfractie in oplossing*
6. dynamische headspace injectie/’purge and trap analysis’: helium borrelt door flesje -> vluchtige stoffen meegesleurd op
adsorberende kolom en daar vastgelegd -> verwarmen: stoffen verder naar GC toestel (toep. grondmonster analyseren)
2.3 KOLOM (voorbeelden p. 25-26)
1. gepakte kolom: - materiaal: roestvrij staal/pyrex
- grootte: 1-3m lange spiraal, d = 0,125-6mm
- stationaire fase: partikels (d = 150-250μm) -> bv. diatomeenaarde
-> voorbehandeling: NAW, AW, AW-DMCS (silanolgroepen maskeren)
2. capillaire kolom: - materiaal: metaal of gesmolten kwarts (‘fused silica’)
- grootte: 5-100m lang patroon, d = 0,1 – 0,53mm
- stationaire fase geadsobeerd als film op binnenwand kolom
- WCOT (wall coated open tubular): vloeibare-/PLOT (porous layer open tubular): vaste stationaire fase
- stationaire fase: hoogkokende vloeistof (polymeer), lage viscositeit, inert en bedekkingsgraad 3-5%
- MAOT (max. allowable operating temperature): indien hier boven gegaan wordt kan bleeding optreden
- K = affiniteit voor stationaire fase (bep. door interacties verbinding-SF) = affiniteit voor mobiele fase (bep. door dampspanning)
- retentie maximaal indien polair + polair of apolair + apolair (voorbeelden p. 29-30)
-> selectiviteit van kolom komt overeen met polariteit
-> polaire kolommen: scheiding o.b.v. polariteit (H-bruggen)
-> apolaire kolommen: scheiding o.b.v. kookpunt
- kolomoven: isotherm -> tijdverspilling op het einde -> temperatuurprogramma (hoe hoger temperatuur, hoe sneller scheiding)
1
, 2.4 DETECTOREN (samenvatting p. 39)
(ruis: schommelingen door interferentie -> spikes: verwaarloosbare pieken, wander↗ en drift↘: sprongen in basislijn)
1. vlamionisatie detector (FID): vlam (H2 + O2) -> verbrandt alle stoffen -> ionen -> e-/stroom -> meet elektrische geleidbaarheid
-> signaal voor alle organische stoffen
2. katarometer (TCD): meet ∆Rweerstanddraad t.g.v. ∆T
3. electron capture detector (ECD): radioactieve bron ioniseert draaggas -> e- vrij -> stof vangt e- -> meet verlaging geleidbaarheid
-> signaal voor stoffen die elektronen kunnen vangen -> E.N. stoffen, bv. halogenen (meer selectief en gevoeliger)
4. vlamfotometrische detector (FPD): vlam -> licht uitgezonden -> door filters -> fotomultiplicatorbuis: licht -> stroom (gemeten)
-> specifiek voor zwavel, fosfor (en halogeenverbindingen)
5. stikstof-fosfor- (NPD)/ thermo-ionisatie detector (TID): selectieve FID o.w.v. verhitting rubidiumzout en lager debiet
6. massaspectrometer (GC-MS): ionen scheiden o.b.v. massa-ladingsverhouding (m/z)
-> meest ideale GC-detector o.w.v. hoge selectiviteit(gekoppelde techniek = hyphenation) (opstelling p. 40)
2.5 DERIVATISERING (overzicht p. 41!!!)
-> vluchtigheid, resolutie en gevoeligheid detectie nemen toe en staartvorming kan vermeden worden
-> silyleringsmiddelen: p. 42-43!!
2.6 TOEPASSINGEN (zie p. 44-50!!!)
- kwalitatieve analyse: o.b.v. (relatieve) retentietijd
- kwantitatieve analyse: zie BOT II
H3: DUNNELAAGCHROMATOGRAFIE (DLC/TLC)
Rf = (retardation-/retentie factor/) ratio to the front
3.1 ADSORPTIE ALS VERTRAGINGSMECHANISME (voor weinig of matig polaire stoffen)
- verzadigingsfenomeen: absorptieplaatsen gradueel gevuld -> bereiken plateauwaarde
- hogere temperatuur -> moleculen bewegen sneller -> minder steile curve en plateau sneller bereikt
- gekromde absorptie-isothermen: adsorptieplaatsen met lage en hoge affiniteit -> knik in curve (mog. verklaring: staartvorming)
- vereenvoudigd model TLC: adsorbens (vaste fase) (vaak silicagel) + solventmoleculen (mobiele fase) (S) + moleculen opgeloste stof (X)
εo = adsorptie-energie per opp.-eenheid voor bepaald adsorptiemateriaal -> affiniteit van S voor adsorbens
Eo = adsorptie-energie per opp.-eenheid voor bepaald adsorptiemateriaal -> affiniteit van X voor adsorbens
--> als εo << Eo dan zal er meer retentie optreden en omgekeerd als εo >> Eo dan zal er minder retentie optreden
--> de εo van een mengsel van solventen kan niet worden bepaald door optelling rekening houdend met hun verhouding
- absorbens = silicagel: kenmerken: witte stof, korrelgrootte 5-10µm en bevat silanolgroepen (licht zure eig.)
silanolgroepen: geïsoleerde- > H-gebonden- > gehydrateerde- > als siloxaan groep
--> activering door verwarmen bij: 100°C (geadsorbeerd water weg) of 400°C (water weg, maar -Si-O- i.p.v. ≡SiOH)
--> interacties: dipool-dipool, H-bruggen en zuur-base (zwak zure silanolen + basen)
- solventspecificiteit: ook interacties in mobiele fase tussen de te scheiden stoffen X en Y en solventmoleculen S
EoX < EoY: scheiding X en Y | EoX = EoY: geen scheiding X en Y | EoX = EoY + solventspecificiteit (interactie Y-S -> rententie Y↘): wel scheiding X en Y
3.2 NORMALE VERDELINGS ALS VERTRAGINGSMECHANISME
- dragermaterialen: o cellulosepoeder: natuurlijke cellulose behandeld met zuur zodat amorfe delen deels verwijderd zijn
o kiezelguhr (diatomeeënaarde): van kiezelwieren, vgl. met silicagel maar minder silanolgroepen
o silicagel: loopmiddel moet aangepast zijn zodat silanolgroepen grotendeels gemaskeerd zijn
- stationaire fasen: voor celluloseplaten -> ontmenging van loopvloeistof aan celluloselaag
voor kiezelguhr -> vooraf drenken in polaire stat. fase (bv. formamide), laten drogen en optrekken met organisch solvent
- bv. 2D TLC van aminozuren (p. 58-60): eerst horizontaal behandelen met zuur loopsysteem, nadien verticaal met basisch-
-> kleurreactie met ninhydrine: 1°AZ paars gekleurd, 2°AZ licht gekleurd en 3°AZ geen kleur
-> systeem I (zuur): effect basische polaire groep meer uitgesproken o.w.v. protonering (NH3+)
systeem II (basisch): effect zure polaire groepen meer uitgesproken o.w.v. ionisatie (COO-)
3.3 OMGEKEERDE FASE VERDELINGSCHROMATOGRAFIE (stationaire fase meer apolair dan mobiele fase!)
- silicagel/kiezelguhr als drager: stationaire fase = paraffine/undecaan
loopvloeistof = HoAc-CH3CN (voor silicaplaten) en Me2COCH3CN (voor kiezelguhr platen)
- chemisch gemodificeerde silicagel: gesilaneerde- (bv. scheiding vetzuren) en gebonden C8/C18 fase (bv. scheiding ftalaten)
3.4 APPARATUUR EN UITVOERING
1. dunnelaagplaat: a. silicagel G (met gips in calciumsulfaat binder) c. silicagel met fluorescentie-indicator (F/UV254)
b. silicagel H (zonder gips) d. HPTLC: high performance (betere kwaliteit)
2. monster aanbrengen: niet te hoge concentratie, microspuit i.g.v. kwantitatief werk, hoeveelheid afhankelijk van detectiegrens
keuze oplosmiddel: monster moet volledig oplossen, kookpunt niet te hoog en bij voorkeur apolair
diameter startvlek zo klein mogelijk en aanbrengen op 2cm van onderste rand
3. ontwikkelen van de plaat: in verzadigde/onverzadigde ontwikkelkamer
vlekken zichtbaar maken: fluorescentie (UV), absorbantie (UV), I2-dampen, verkolen, besproeien met specifiek reagens of densitometrie (p. 63)
4. berekenen van Rf: Rf = d/l (d = afstand die stof heeft afgelegd vanaf startplaats en l = afstand die solvent heeft afgelegd van start tot solventfront)
2
