Scheiding & zuivering
Elektroforese alle formules
Elektroforese = de beweging van een geladen molecule (macro-ion) in een elektrisch veld, de
nettolading van de molecule is q=ze, waarbij e de eenheidslading is en z het aantal
eenheidsladingen.
Elektroforetische mobiliteit U: is de verhouding van de migratiesnelheid op het elektrische
veld
U= elektroforetische mobiliteit
E= elektrisch veld
q= nettolading
Bovenstaande formule moest worden aangepast, omdat deze formule is voor macromolecule
opgelost in een solvent zonder tegenionen.
De volgende formule houdt wel rekening met elektrostatische krachten tussen de ladingen van
de moleculen en ionen die de elektroforetische mobiliteit verlaagt.
U= elektroforetische snelheid
ze= nettolading
n= viscositeit van de oplosssing
R= Stokes radius; afmetingen van het macro-ion
k= het omgekeerde van de straal r waarover macromoleculen elkaar nog kunnen beïnvloeden -
> beïnvloedt mobiliteit
Proteïnen, RNA en DNA hebben lading als gevolg van zure en basische groepen waardoor ze
migreren in een elektrisch veld bij een pH die verschilt van hun iso-elektrisch punt. De
migratie wordt bepaald door de verhouding van de lading tot de massa: sneller naar anode als
meer negatieve ladingen bevat.
Scheiding op basis van grootte: kleinere moleculen geraken gemakkelijker door de mazen van
het netwerk waardoor ze migreren tegenover grotere moleculen.
Bufferoplossing:
pH in de elektrode reservoirs en in de dragen blijft constant
de elektroliet concentratie is aanvaardbaard om de stroom te dragren
, de elektroforese buffer mag niet reageren met de macromoleculen tijdens de
migratie
Types elektroforese
Dunlaagelektroforese
Gelelektroforese
o Agarase gelelektroforese
o Polyacrylamide gelelektroforese
o Iso-elektrofocusering
Detectie van eiwitten en nucleïnezuren na gelelektroforese
CBB
Zilverkleuring
Fluorochromen
Identificatie van eiwitten en nucleïnezuren na gelelektroforese
Western blot
Southern en Northern blot
Massaspectrometrie
Capillaire elektroforese
Dunlaagelektroforese
Platen (glas, teflon, plastiek) worden bedekt met een drager (cellulose, silicia). De platen
worden bevochtigd en verbonden met de elektrodebuffers. De elektroforese wordt in een
afgesloten systeem uitgevoerd, omdat de elektrodebuffers een lage ionensterkte hebben en
vluchtige stoffen kan bevatten. Geladen moleculen gaan bewegen wanneer een spanning
wordt aangelegd. Er wordt gebruik gemaakt van geladen kleurstffen oom de elektroforese op
te volgen. De moleculen bewegen zich door de drager waarbij de drager als zeef fungeert.
(=1D)
2D elektroforese in twee richtingen loodrecht op elkaar in verschillende buffers of in één
richting gecombineerd met chromotografie in de andere richting, gescheiden stoffen zichtbaar
maken met kleurreactie
Gelelektroforese
Scheiding van macromoleculen in een gepolymeriseerd gelsysteem.
Voordelen:
, Hoge capaciteit
Gecontroleerde porositeit
Verhindering convectie (door opwarming buffer)
Minimaliseren diffusie
Snelle eletroforetische beweging
Scheiding op basis van moleculair zeefeffect
Agarose gelelektroforese
Scheiding van nucleïnezuren
Agarose gel wordt gemaakt door het oplossen van agarosepoeder. De poriëngrootte wordt
bepaald door de concentratie agarose. Bv. als je grote moleculen wilt scheiden heb je grote
poriën nodig dus een lagere concentratie.
Agarose polymeriseert door afkoeling.
Relatie tussen de afgelegde afstand en de molecuulmassa: de snelheid daalt logaritmisch met
stijgende molecuulmassa:
Rf= afgelegde afstand
M= molecuulmassa
A en B= afhankelijk van elektroforesesysteem en zijn experimenteel te bepalen met referentie
moleculen
Polyacrylamide gelelektroforese
Scheiden van eiwitten en soms voor korte nucleïnezuren
Polyacrylamide gel wordt gemaakt door polymerisatie van acrylamide en N-N’-
methylenebisacrylamide in aanwezigheid van radicalen. De poriëngrootte wordt bepaald door
de concentratie acrylamide en de verhouding acrylamide/bisacrylamide.
T = totale concentratie aan acrylamide/bisacrylamide
C= concentratie crosslinker = bisacrylamide
a= gewicht acrylamide
b= gewicht bisacrylamide
V=volume mengesel
T + C veranderen -> verschillende porositeit
Continue buffersysteem: wanneer elektroforese wordt uitgevoerd met éénzelfde buffer in het
staal, gel en elektrode reservoirs. Scheiding bepaalt door zeefeffect. Nadeel: grootte van het
Elektroforese alle formules
Elektroforese = de beweging van een geladen molecule (macro-ion) in een elektrisch veld, de
nettolading van de molecule is q=ze, waarbij e de eenheidslading is en z het aantal
eenheidsladingen.
Elektroforetische mobiliteit U: is de verhouding van de migratiesnelheid op het elektrische
veld
U= elektroforetische mobiliteit
E= elektrisch veld
q= nettolading
Bovenstaande formule moest worden aangepast, omdat deze formule is voor macromolecule
opgelost in een solvent zonder tegenionen.
De volgende formule houdt wel rekening met elektrostatische krachten tussen de ladingen van
de moleculen en ionen die de elektroforetische mobiliteit verlaagt.
U= elektroforetische snelheid
ze= nettolading
n= viscositeit van de oplosssing
R= Stokes radius; afmetingen van het macro-ion
k= het omgekeerde van de straal r waarover macromoleculen elkaar nog kunnen beïnvloeden -
> beïnvloedt mobiliteit
Proteïnen, RNA en DNA hebben lading als gevolg van zure en basische groepen waardoor ze
migreren in een elektrisch veld bij een pH die verschilt van hun iso-elektrisch punt. De
migratie wordt bepaald door de verhouding van de lading tot de massa: sneller naar anode als
meer negatieve ladingen bevat.
Scheiding op basis van grootte: kleinere moleculen geraken gemakkelijker door de mazen van
het netwerk waardoor ze migreren tegenover grotere moleculen.
Bufferoplossing:
pH in de elektrode reservoirs en in de dragen blijft constant
de elektroliet concentratie is aanvaardbaard om de stroom te dragren
, de elektroforese buffer mag niet reageren met de macromoleculen tijdens de
migratie
Types elektroforese
Dunlaagelektroforese
Gelelektroforese
o Agarase gelelektroforese
o Polyacrylamide gelelektroforese
o Iso-elektrofocusering
Detectie van eiwitten en nucleïnezuren na gelelektroforese
CBB
Zilverkleuring
Fluorochromen
Identificatie van eiwitten en nucleïnezuren na gelelektroforese
Western blot
Southern en Northern blot
Massaspectrometrie
Capillaire elektroforese
Dunlaagelektroforese
Platen (glas, teflon, plastiek) worden bedekt met een drager (cellulose, silicia). De platen
worden bevochtigd en verbonden met de elektrodebuffers. De elektroforese wordt in een
afgesloten systeem uitgevoerd, omdat de elektrodebuffers een lage ionensterkte hebben en
vluchtige stoffen kan bevatten. Geladen moleculen gaan bewegen wanneer een spanning
wordt aangelegd. Er wordt gebruik gemaakt van geladen kleurstffen oom de elektroforese op
te volgen. De moleculen bewegen zich door de drager waarbij de drager als zeef fungeert.
(=1D)
2D elektroforese in twee richtingen loodrecht op elkaar in verschillende buffers of in één
richting gecombineerd met chromotografie in de andere richting, gescheiden stoffen zichtbaar
maken met kleurreactie
Gelelektroforese
Scheiding van macromoleculen in een gepolymeriseerd gelsysteem.
Voordelen:
, Hoge capaciteit
Gecontroleerde porositeit
Verhindering convectie (door opwarming buffer)
Minimaliseren diffusie
Snelle eletroforetische beweging
Scheiding op basis van moleculair zeefeffect
Agarose gelelektroforese
Scheiding van nucleïnezuren
Agarose gel wordt gemaakt door het oplossen van agarosepoeder. De poriëngrootte wordt
bepaald door de concentratie agarose. Bv. als je grote moleculen wilt scheiden heb je grote
poriën nodig dus een lagere concentratie.
Agarose polymeriseert door afkoeling.
Relatie tussen de afgelegde afstand en de molecuulmassa: de snelheid daalt logaritmisch met
stijgende molecuulmassa:
Rf= afgelegde afstand
M= molecuulmassa
A en B= afhankelijk van elektroforesesysteem en zijn experimenteel te bepalen met referentie
moleculen
Polyacrylamide gelelektroforese
Scheiden van eiwitten en soms voor korte nucleïnezuren
Polyacrylamide gel wordt gemaakt door polymerisatie van acrylamide en N-N’-
methylenebisacrylamide in aanwezigheid van radicalen. De poriëngrootte wordt bepaald door
de concentratie acrylamide en de verhouding acrylamide/bisacrylamide.
T = totale concentratie aan acrylamide/bisacrylamide
C= concentratie crosslinker = bisacrylamide
a= gewicht acrylamide
b= gewicht bisacrylamide
V=volume mengesel
T + C veranderen -> verschillende porositeit
Continue buffersysteem: wanneer elektroforese wordt uitgevoerd met éénzelfde buffer in het
staal, gel en elektrode reservoirs. Scheiding bepaalt door zeefeffect. Nadeel: grootte van het
