Algemene inleiding
Doel
Het
verwerven
van
een
zo
volledig
mogelijk
inzicht
in
de
samenstelling
van
de
materie
§ Als
basiswetenschap:
ontwikkelen
en/of
verfijnen
van
bestaande
analytische
technieken
en/of
methoden.
§ Als
hulpwetenschap:
essentieel
voor
het
beoefenen
van
talrijke
wetenschappen,
zoals
biochemie,
klinische
chemie,
geologie,
ecologie,
…
§ Als
toegepaste
wetenschap:
belangrijke
economische
rol
à
analyse
van
grondstoffen
à
controle
industriële
productie:
opgelegde
normen,
dosering,
zuiverheid
à
farmaceutische
industrie,
petrochemie,
voedingsindustrie
Basisbegrippen
Specificiteit
en
selectiviteit
Een
reactie
is
specifiek
wanneer
ze
enkel
opgaat
voor
het
te
doseren
bestanddeel.
Een
reactie
is
selectief
wanneer
ze
een
voorkeur
vertoont
voor
het
te
doseren
bestanddeel,
maar
desondanks
ook
positief
kan
reageren
op
andere
bestanddelen.
Gevoeligheid
of
sensitiviteit
De
gevoeligheid
van
een
test
wordt
bepaald
door
de
helling
van
de
ijkcurve.
§ gevoeligheid
=
signaal
per
eenheidsconcentratie.
§ gevoeligheid
=
gemeten
signaal
/
concentratie.
Karakteristieke
concentratie:
Dit
is
de
hoeveelheid
van
een
te
bepalen
stof
(
in
µg)
die
een
absorbantie
van
0,0044
(1%
absorbantie)
teweegbrengt.
Detectielimiet
en
kwantificatielimiet
Detectielimiet:
§ Dit
is
de
minimale
concentratie
van
een
bepaalde
stof
die
een
signaal-‐over-‐ruis
ratio
van
2
teweegbrengt.
§ Soms
wordt
er
ook
3
keer
de
standaard
deviatie
van
het
blanco
signaal
gebruikt
§ Betere
parameter
dan
de
gevoeligheid,
omdat
het
ook
het
achtergrondsignaal
in
berekening
neemt
en
niet
enkel
de
signaal-‐
sterkte.
Kwantificatielimiet
LOD:
detectielimiet
Dit
is
de
laagste
concentratie
die
kwantitatief
LOQ:
kwantificatielimiet
bepaald
kan
worden
en
is
gelijk
aan
10
keer
de
LOL:
lineariteitslimiet
standaard
deviatie
van
het
blanco
signaal.
1
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
algemene
inleiding
,
Blancobepaling
Dit
is
de
bepaling
van
de
fractie
van
het
totaalsignaal
dat
niet
te
wijten
is
aan
het
te
doseren
bestanddeel,
bijvoorbeeld
het
deel
van
de
absorptie
die
te
wijten
is
aan
het
solvent.
Accuraatheid
en
precisie
Accuraatheid:
Dit
is
een
maat
voor
de
afwijking
van
de
gemeten
waarde
tegenover
de
werkelijke
waarde.
PROBLEEM
IN
DE
ACCURAATHEID:
verschuiving
van
het
gemiddelde
(µ).
Precisie:
Dit
is
een
maat
voor
de
reproduceerbaarheid
van
analyseresultaten
§ Intra-‐variatiecoëfficiënt:
de
gemiddelde
afwijking
tegenover
het
gemiddelde
binnen
dezelfde
run
en
dus
onder
dezelfde
condities
§ Inter-‐variatiecoëfficiënt:
de
gemiddelde
afwijking
tegenover
het
gemiddelde
bij
verschillende
runs
§ VC
=
SD/µ
PROBLEEM
IN
DE
PRECISIE:
stijging
van
de
standaardafwijking
(SD).
Indeling
Volgens
de
aard
van
analyse
Kwalitatieve
analyse:
beoogt
identificatie,
detectie
of
aantonen
van
de
bestanddelen
van
een
staal.
Kwantitatieve
analyse:
beoogt
het
bepalen
van
de
relatieve
hoeveelheid
van
één
of
meerdere
bestanddelen
in
een
staal.
Volgens
de
monstername
Grootte
van
monstername:
§ macro-‐analyse
>
100
mg
>
100
µl
§ semi-‐micro-‐analyse
10-‐100
mg
50-‐100
µl
§ micro-‐analyse
1-‐10
mg
<
50
µl
§ ultra-‐micro-‐analyse
<
1
mg
Gehalte
van
het
te
bepalen
bestanddeel:
§ hoofdbestanddeel
>
1%
§ nevenbestanddeel
0,1
–
1%
§ sporen
bestanddeel
<0,1%
§ ultra-‐sporen
bestanddeel
ppt,
ppb,
ppm
Volgens
de
gebruikte
techniek/methode
Chemische
of
klassieke
meetmethoden:
Gebaseerd
op
een
stochiometrische
reactie
tussen
de
te
analyseren
stof
X
en
een
reagens
R
onder
de
vorming
van
een
product
P
2
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
algemene
inleiding
,
§ maatanalyse
(titrimetrie,
volumetrie)
:
X
+
R
à
P
§ gewichtsanalyse
(gravimetrie):
na
precipitatie:
X
+
R
à
P$
na
verluchting
:
X
+
R
à
P#
fysioco-‐chemische
of
instrumentele
methoden:
meting
van
een
fysische
of
fysioco-‐chemische
grootheid
van
het
te
analyseren
monster,
hetzij
rechtstreeks
of
in
oplossing,
al
dan
niet
na
een
bijkomende
chemische
reactie.
§ Elektrochemische
methoden:
gebaseerd
op
de
wisselwerking
tussen
chemische
en
elektrische
verschijnselen
in
elektrolytoplossingen.
Vb:
potentiometrie,
coulometrie
§ Optische
methoden:
gebaseerd
op
de
wisselwerking
tussen
materie
en
lichtstraling.
Vb:
spectrofotometrie,
fluorimetrie
§ Radiochemische
methoden:
gebaseerd
op
het
toepassen
van
radioisotopen
in
analyseprocessen
of
het
induceren
van
radioactiviteit
in
het
te
analyseren
monster.
Vb:
isotopendilutie,
radioactief
gemerkt
AL,
neutronen
activering
§ Chromatografische
analyse:
scheidingstechniek
gebaseerd
op
verschillen
in
migratiesnelheid
waarmee
individuele
componenten
van
een
moleculair
mengsel
zich
doorheen
een
stationair
medium
bewegen
o.i.v.
een
mobiele
fase.
Biologische
methoden:
gebaseerd
op
het
gebruik
van
specifieke
biomoleculen
(enzymen,
AL)
of
van
biologische
processen
die
door
het
te
bepalen
bestanddeel
worden
beïnvloed.
§ Immunoprecipitatie
technieken
§ Radio-‐immunologische
technieken
(RIA)
§ Enzymimmunobepaling
(ELISA)
Fasen
van
een
chemische
analyse
1. Definiëren
van
het
analyse
probleem
2. Monstername
3. Voorbereiden
van
het
monster
4. Procedures
voor
eliminatie
van
interferenties
of
aanrijken
van
de
concentratie
5. De
bepaling
zelf
Fouten
in
kwantitatieve
analyse
Elke
stap
kan
een
bron
van
fouten
zijn.
Vb:
monstername,
kalibratie,
verdunningen,
…
Systematische
fouten
§ Instrumentele
fouten
§ Methodische
fouten
§ Persoonlijke
fouten
Verwerpen
van
resultaten
o.w.v
een
sterke
afwijking
tegenover
het
gemiddelde
(=
outlier).
Een
outlier
mag
pas
verwijderd
worden
als:
§ De
afwijking
>
4
keer
de
gemiddelde
afwijking
§ De
afwijking
>
3
keer
de
standaard
deviatie
3
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
algemene
inleiding
,
Kalibratie
Kalibratie
van
de
meetapparatuur
Is
nodig
op
tijdens
de
analyse
een
accuraat
signaal
te
meten.
§ Het
gebeurt
aan
de
hand
van
standaarden
met
een
gekend
meetsignaal
§ Bij
veel
moderne
apparatuur
gebeurt
dit
quasi
automatisch
Kalibratie
van
de
analyse
methode
De
kalibratiefunctie
geeft
de
relatie
tussen
het
door
de
apparatuur
gegenereerde
signaal
y
en
de
concentratie
van
het
te
bepalen
bestanddeel
x:
y
=
f(x).
De
kalibratie
wordt
bekomen
door
een
aantal
stalen
te
meten
met
een
gekend
meetsignaal.
2
methoden:
§ Externe
kalibratie:
toegepast
wanneer
het
gekomen
signaal
niet
onderhevig
is
aan
matrixeffecten.
§ Interne
kalibratie:
vereist
wanneer
het
gegenereerde
signaal
in
het
te
analyseren
monster
onderhevig
is
aan
matrix-‐
of
chemische
interferentie
of
wanneer
de
methode
en/of
meet-‐
apparatuur
het
voorwerp
is
van
veranderende
experimentele
parameters
tijdens
het
verloop
van
de
analyse.
Externe
kalibratie
(=directe
kalibratie):
§ Éénpuntskalibratie:
Hierbij
vergelijk
je
het
signaal
van
je
onbekende
met
het
signaal
van
een
kalibrator
met
gekende
concentratie.
𝐶! 𝐶! 𝐶! 𝑥 𝑆!
= <=> 𝐶! =
𝑆! 𝑆! 𝑆!
Nadelen:
de
lineariteit
moet
vooraf
gecontroleerd
zijn
de
accuraatheid
hangt
slechts
af
van
één
ijkpunt
§ Meerpuntskalibratie
(=ijklijn):
à
Maken
van
een
verdunningsreeks
vanuit
een
gekende
stockconcentratie
à
Opstellen
van
een
ijklijn
+
vergelijking
opstellen
à
Concentratie
van
een
onbekend
staal
berekenen
(bekomen
signaal
in
de
vergelijking
invullen)
Opmerkingen:
nooit
extrapoleren
naar
meetwaarden
buiten
de
ijklijn
(kleinere
verdunning,
…)
binnen
het
lineair
gedeelte
van
de
ijklijn
blijven
voor
sommige
analyses
bestaat
er
geen
lineair
verband
→
LOG
nemen
4
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Kalibratie
Doel
Het
verwerven
van
een
zo
volledig
mogelijk
inzicht
in
de
samenstelling
van
de
materie
§ Als
basiswetenschap:
ontwikkelen
en/of
verfijnen
van
bestaande
analytische
technieken
en/of
methoden.
§ Als
hulpwetenschap:
essentieel
voor
het
beoefenen
van
talrijke
wetenschappen,
zoals
biochemie,
klinische
chemie,
geologie,
ecologie,
…
§ Als
toegepaste
wetenschap:
belangrijke
economische
rol
à
analyse
van
grondstoffen
à
controle
industriële
productie:
opgelegde
normen,
dosering,
zuiverheid
à
farmaceutische
industrie,
petrochemie,
voedingsindustrie
Basisbegrippen
Specificiteit
en
selectiviteit
Een
reactie
is
specifiek
wanneer
ze
enkel
opgaat
voor
het
te
doseren
bestanddeel.
Een
reactie
is
selectief
wanneer
ze
een
voorkeur
vertoont
voor
het
te
doseren
bestanddeel,
maar
desondanks
ook
positief
kan
reageren
op
andere
bestanddelen.
Gevoeligheid
of
sensitiviteit
De
gevoeligheid
van
een
test
wordt
bepaald
door
de
helling
van
de
ijkcurve.
§ gevoeligheid
=
signaal
per
eenheidsconcentratie.
§ gevoeligheid
=
gemeten
signaal
/
concentratie.
Karakteristieke
concentratie:
Dit
is
de
hoeveelheid
van
een
te
bepalen
stof
(
in
µg)
die
een
absorbantie
van
0,0044
(1%
absorbantie)
teweegbrengt.
Detectielimiet
en
kwantificatielimiet
Detectielimiet:
§ Dit
is
de
minimale
concentratie
van
een
bepaalde
stof
die
een
signaal-‐over-‐ruis
ratio
van
2
teweegbrengt.
§ Soms
wordt
er
ook
3
keer
de
standaard
deviatie
van
het
blanco
signaal
gebruikt
§ Betere
parameter
dan
de
gevoeligheid,
omdat
het
ook
het
achtergrondsignaal
in
berekening
neemt
en
niet
enkel
de
signaal-‐
sterkte.
Kwantificatielimiet
LOD:
detectielimiet
Dit
is
de
laagste
concentratie
die
kwantitatief
LOQ:
kwantificatielimiet
bepaald
kan
worden
en
is
gelijk
aan
10
keer
de
LOL:
lineariteitslimiet
standaard
deviatie
van
het
blanco
signaal.
1
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
algemene
inleiding
,
Blancobepaling
Dit
is
de
bepaling
van
de
fractie
van
het
totaalsignaal
dat
niet
te
wijten
is
aan
het
te
doseren
bestanddeel,
bijvoorbeeld
het
deel
van
de
absorptie
die
te
wijten
is
aan
het
solvent.
Accuraatheid
en
precisie
Accuraatheid:
Dit
is
een
maat
voor
de
afwijking
van
de
gemeten
waarde
tegenover
de
werkelijke
waarde.
PROBLEEM
IN
DE
ACCURAATHEID:
verschuiving
van
het
gemiddelde
(µ).
Precisie:
Dit
is
een
maat
voor
de
reproduceerbaarheid
van
analyseresultaten
§ Intra-‐variatiecoëfficiënt:
de
gemiddelde
afwijking
tegenover
het
gemiddelde
binnen
dezelfde
run
en
dus
onder
dezelfde
condities
§ Inter-‐variatiecoëfficiënt:
de
gemiddelde
afwijking
tegenover
het
gemiddelde
bij
verschillende
runs
§ VC
=
SD/µ
PROBLEEM
IN
DE
PRECISIE:
stijging
van
de
standaardafwijking
(SD).
Indeling
Volgens
de
aard
van
analyse
Kwalitatieve
analyse:
beoogt
identificatie,
detectie
of
aantonen
van
de
bestanddelen
van
een
staal.
Kwantitatieve
analyse:
beoogt
het
bepalen
van
de
relatieve
hoeveelheid
van
één
of
meerdere
bestanddelen
in
een
staal.
Volgens
de
monstername
Grootte
van
monstername:
§ macro-‐analyse
>
100
mg
>
100
µl
§ semi-‐micro-‐analyse
10-‐100
mg
50-‐100
µl
§ micro-‐analyse
1-‐10
mg
<
50
µl
§ ultra-‐micro-‐analyse
<
1
mg
Gehalte
van
het
te
bepalen
bestanddeel:
§ hoofdbestanddeel
>
1%
§ nevenbestanddeel
0,1
–
1%
§ sporen
bestanddeel
<0,1%
§ ultra-‐sporen
bestanddeel
ppt,
ppb,
ppm
Volgens
de
gebruikte
techniek/methode
Chemische
of
klassieke
meetmethoden:
Gebaseerd
op
een
stochiometrische
reactie
tussen
de
te
analyseren
stof
X
en
een
reagens
R
onder
de
vorming
van
een
product
P
2
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
algemene
inleiding
,
§ maatanalyse
(titrimetrie,
volumetrie)
:
X
+
R
à
P
§ gewichtsanalyse
(gravimetrie):
na
precipitatie:
X
+
R
à
P$
na
verluchting
:
X
+
R
à
P#
fysioco-‐chemische
of
instrumentele
methoden:
meting
van
een
fysische
of
fysioco-‐chemische
grootheid
van
het
te
analyseren
monster,
hetzij
rechtstreeks
of
in
oplossing,
al
dan
niet
na
een
bijkomende
chemische
reactie.
§ Elektrochemische
methoden:
gebaseerd
op
de
wisselwerking
tussen
chemische
en
elektrische
verschijnselen
in
elektrolytoplossingen.
Vb:
potentiometrie,
coulometrie
§ Optische
methoden:
gebaseerd
op
de
wisselwerking
tussen
materie
en
lichtstraling.
Vb:
spectrofotometrie,
fluorimetrie
§ Radiochemische
methoden:
gebaseerd
op
het
toepassen
van
radioisotopen
in
analyseprocessen
of
het
induceren
van
radioactiviteit
in
het
te
analyseren
monster.
Vb:
isotopendilutie,
radioactief
gemerkt
AL,
neutronen
activering
§ Chromatografische
analyse:
scheidingstechniek
gebaseerd
op
verschillen
in
migratiesnelheid
waarmee
individuele
componenten
van
een
moleculair
mengsel
zich
doorheen
een
stationair
medium
bewegen
o.i.v.
een
mobiele
fase.
Biologische
methoden:
gebaseerd
op
het
gebruik
van
specifieke
biomoleculen
(enzymen,
AL)
of
van
biologische
processen
die
door
het
te
bepalen
bestanddeel
worden
beïnvloed.
§ Immunoprecipitatie
technieken
§ Radio-‐immunologische
technieken
(RIA)
§ Enzymimmunobepaling
(ELISA)
Fasen
van
een
chemische
analyse
1. Definiëren
van
het
analyse
probleem
2. Monstername
3. Voorbereiden
van
het
monster
4. Procedures
voor
eliminatie
van
interferenties
of
aanrijken
van
de
concentratie
5. De
bepaling
zelf
Fouten
in
kwantitatieve
analyse
Elke
stap
kan
een
bron
van
fouten
zijn.
Vb:
monstername,
kalibratie,
verdunningen,
…
Systematische
fouten
§ Instrumentele
fouten
§ Methodische
fouten
§ Persoonlijke
fouten
Verwerpen
van
resultaten
o.w.v
een
sterke
afwijking
tegenover
het
gemiddelde
(=
outlier).
Een
outlier
mag
pas
verwijderd
worden
als:
§ De
afwijking
>
4
keer
de
gemiddelde
afwijking
§ De
afwijking
>
3
keer
de
standaard
deviatie
3
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
algemene
inleiding
,
Kalibratie
Kalibratie
van
de
meetapparatuur
Is
nodig
op
tijdens
de
analyse
een
accuraat
signaal
te
meten.
§ Het
gebeurt
aan
de
hand
van
standaarden
met
een
gekend
meetsignaal
§ Bij
veel
moderne
apparatuur
gebeurt
dit
quasi
automatisch
Kalibratie
van
de
analyse
methode
De
kalibratiefunctie
geeft
de
relatie
tussen
het
door
de
apparatuur
gegenereerde
signaal
y
en
de
concentratie
van
het
te
bepalen
bestanddeel
x:
y
=
f(x).
De
kalibratie
wordt
bekomen
door
een
aantal
stalen
te
meten
met
een
gekend
meetsignaal.
2
methoden:
§ Externe
kalibratie:
toegepast
wanneer
het
gekomen
signaal
niet
onderhevig
is
aan
matrixeffecten.
§ Interne
kalibratie:
vereist
wanneer
het
gegenereerde
signaal
in
het
te
analyseren
monster
onderhevig
is
aan
matrix-‐
of
chemische
interferentie
of
wanneer
de
methode
en/of
meet-‐
apparatuur
het
voorwerp
is
van
veranderende
experimentele
parameters
tijdens
het
verloop
van
de
analyse.
Externe
kalibratie
(=directe
kalibratie):
§ Éénpuntskalibratie:
Hierbij
vergelijk
je
het
signaal
van
je
onbekende
met
het
signaal
van
een
kalibrator
met
gekende
concentratie.
𝐶! 𝐶! 𝐶! 𝑥 𝑆!
= <=> 𝐶! =
𝑆! 𝑆! 𝑆!
Nadelen:
de
lineariteit
moet
vooraf
gecontroleerd
zijn
de
accuraatheid
hangt
slechts
af
van
één
ijkpunt
§ Meerpuntskalibratie
(=ijklijn):
à
Maken
van
een
verdunningsreeks
vanuit
een
gekende
stockconcentratie
à
Opstellen
van
een
ijklijn
+
vergelijking
opstellen
à
Concentratie
van
een
onbekend
staal
berekenen
(bekomen
signaal
in
de
vergelijking
invullen)
Opmerkingen:
nooit
extrapoleren
naar
meetwaarden
buiten
de
ijklijn
(kleinere
verdunning,
…)
binnen
het
lineair
gedeelte
van
de
ijklijn
blijven
voor
sommige
analyses
bestaat
er
geen
lineair
verband
→
LOG
nemen
4
Samenvatting
biochemische
analyse
-‐
Kalibratie
