Hoofdstuk 2: Enzymkinetiek
Begrijpen van de begrippen initiële snelheid, pre- stationaire en stationaire
fase in het tijdsverloop van een enzymatische reactie (=enzymkinetiek)
INITIËLE SNELHEID
De snelheid van productvorming is niet lineair en daalt met de tijd
doordat:
• het enzym zijn activiteit verliest bij de temperatuur en pH van de
reactie.
• er een terugvorming is van S uit P bij hoge productconcentraties
(ook k-2 reactie naarmate P gevormd wordt).
• het enzym geïnhibeerd wordt door de gevormde producten.
Om al deze effecten uit te sluiten gebruikt men de initiële snelheid V0 van
de enzymatische reactie.
Dit is de snelheid geëxtrapoleerd naar het tijdstip t ≈ 0, waarbij de 2de stap
een simpele 1ste orde reactie is.
PRE-STATIONAIRE FASE
Orde van milliseconden: vorming van ES en omzetting van product
STEADY-STATE
vorming ES = afbraak ES: evenwicht bereikt in de reactie tusssen E en S
coor de vorming van het ES complex
de vorming van product per tijdseenheid zal constant blijven en zal
hierdoor de concentratie van ES niet veranderen (d[ES]/dt = 0).
Deze fase duurt zolang de substraatconcentratie het enzym kan
verzadigen.
In deze fase meet men de initiële snelheid (V0) om de kinetiek van de
enzymatische reactie te bestuderen.
• De specificiteit van de enzymatische reactie wordt bepaald door de
vorming van een enzym-substraat (ES) complex of complex van
Michaelis.
• De initiële snelheid V0 wordt per definitie bepaald op t=0 maar met
de veronderstelling dat de reactie dan al in de steady state zit,
gezien de pre-steady state te snel gaat om gemeten te kunnen
worden.
Begrijpen en toepassen van het effect van enzymconcentratie op de
enzymkinetiek
De snelheid van een enzymatische reactie is recht evenredig met de
enzymconcentratie.
V=k[E]
Niet-lineariteit is het gevolg van beperkingen in de detectiemethode of het
gebruik van onzuivere enzympreparaten.
Enzymen zijn de werkmannen: recht evenredig: lineair (maar in de praktijk
niet 100% lineair)
Niet meer moeten zeggen
, Begrijpen en toepassen van het effect van substraat concentratie op de
enzymkinetiek
We vertrekken met de initiële snelheid
Op formule komen die initiële snelheid geeft tov concentratie
Steady state: ES concentratie verandert niet. Omzetten S in product
MICHAELIS-MENTEN VERGELIJKING
Michaelisconstante
Vmax = k2[E]0 Want concentratie E0 = concentratie ES
Rechthoekige hyperbool met asymptoten V0 = Vmax en S = − Km.
BETEKENIS Vmax
Bij oneindig grote [S] zal Vmax bereikt worden!
BETEKENIS Km
Wanneer [S] = Km zal V = ½ Vmax.
Km is een waarde voor de substraat concentratie die nodig is om een
effectieve katalyse te doen doorgaan (een significante versnelling te
bekomen).
Voor vele enzymen is de Km ongeveer gelijk aan de in vivo substraat
concentratie.
Op die manier is er groot effect op de snelheid bij kleine veranderingen in
[S], gezien dit nog het lineaire gedeelte is van de MM curve
Wanneer k -1 >>> k2 = Km dan k-1/k1 = Kd= dissociatieconstante van ES
Hier iq Km een waarde voor de affiniteit van E voor S, waarbij de Km
omgekeerd evenredig is met de affiniteit van E voor S.
Vele enzymatische reacties bestaan uit meerdere stappen!!
In een multistapsreactie wordt k2 vervangen door kcat : Hypothetische
constante
Vmax = kcat[E]0
Hoewel kcat niet specifiek verwijst naar één bepaalde stap in het
reactiemechanisme is het een eerste orde snelheidsconstante welke de
capaciteit definieert van het gevormde ES complex om P te vormen.
Betekenis kcat ‘turnover number’
eenheid s-1, aantal katalystische reacties dat een enzyme kan uitvoeren in
1 seconde.
Betekenis kcat/Km
een maat voor de katalytische efficiëntie van een enzym
Bij lage [S] (veel lager dan Km) is dus
Onder deze voorwaarden is dat de snelheidsconstante voor het vormen
van een ES-complex. = katalytische efficiëntie/enzym efficiëntie.
Begrijpen van de begrippen initiële snelheid, pre- stationaire en stationaire
fase in het tijdsverloop van een enzymatische reactie (=enzymkinetiek)
INITIËLE SNELHEID
De snelheid van productvorming is niet lineair en daalt met de tijd
doordat:
• het enzym zijn activiteit verliest bij de temperatuur en pH van de
reactie.
• er een terugvorming is van S uit P bij hoge productconcentraties
(ook k-2 reactie naarmate P gevormd wordt).
• het enzym geïnhibeerd wordt door de gevormde producten.
Om al deze effecten uit te sluiten gebruikt men de initiële snelheid V0 van
de enzymatische reactie.
Dit is de snelheid geëxtrapoleerd naar het tijdstip t ≈ 0, waarbij de 2de stap
een simpele 1ste orde reactie is.
PRE-STATIONAIRE FASE
Orde van milliseconden: vorming van ES en omzetting van product
STEADY-STATE
vorming ES = afbraak ES: evenwicht bereikt in de reactie tusssen E en S
coor de vorming van het ES complex
de vorming van product per tijdseenheid zal constant blijven en zal
hierdoor de concentratie van ES niet veranderen (d[ES]/dt = 0).
Deze fase duurt zolang de substraatconcentratie het enzym kan
verzadigen.
In deze fase meet men de initiële snelheid (V0) om de kinetiek van de
enzymatische reactie te bestuderen.
• De specificiteit van de enzymatische reactie wordt bepaald door de
vorming van een enzym-substraat (ES) complex of complex van
Michaelis.
• De initiële snelheid V0 wordt per definitie bepaald op t=0 maar met
de veronderstelling dat de reactie dan al in de steady state zit,
gezien de pre-steady state te snel gaat om gemeten te kunnen
worden.
Begrijpen en toepassen van het effect van enzymconcentratie op de
enzymkinetiek
De snelheid van een enzymatische reactie is recht evenredig met de
enzymconcentratie.
V=k[E]
Niet-lineariteit is het gevolg van beperkingen in de detectiemethode of het
gebruik van onzuivere enzympreparaten.
Enzymen zijn de werkmannen: recht evenredig: lineair (maar in de praktijk
niet 100% lineair)
Niet meer moeten zeggen
, Begrijpen en toepassen van het effect van substraat concentratie op de
enzymkinetiek
We vertrekken met de initiële snelheid
Op formule komen die initiële snelheid geeft tov concentratie
Steady state: ES concentratie verandert niet. Omzetten S in product
MICHAELIS-MENTEN VERGELIJKING
Michaelisconstante
Vmax = k2[E]0 Want concentratie E0 = concentratie ES
Rechthoekige hyperbool met asymptoten V0 = Vmax en S = − Km.
BETEKENIS Vmax
Bij oneindig grote [S] zal Vmax bereikt worden!
BETEKENIS Km
Wanneer [S] = Km zal V = ½ Vmax.
Km is een waarde voor de substraat concentratie die nodig is om een
effectieve katalyse te doen doorgaan (een significante versnelling te
bekomen).
Voor vele enzymen is de Km ongeveer gelijk aan de in vivo substraat
concentratie.
Op die manier is er groot effect op de snelheid bij kleine veranderingen in
[S], gezien dit nog het lineaire gedeelte is van de MM curve
Wanneer k -1 >>> k2 = Km dan k-1/k1 = Kd= dissociatieconstante van ES
Hier iq Km een waarde voor de affiniteit van E voor S, waarbij de Km
omgekeerd evenredig is met de affiniteit van E voor S.
Vele enzymatische reacties bestaan uit meerdere stappen!!
In een multistapsreactie wordt k2 vervangen door kcat : Hypothetische
constante
Vmax = kcat[E]0
Hoewel kcat niet specifiek verwijst naar één bepaalde stap in het
reactiemechanisme is het een eerste orde snelheidsconstante welke de
capaciteit definieert van het gevormde ES complex om P te vormen.
Betekenis kcat ‘turnover number’
eenheid s-1, aantal katalystische reacties dat een enzyme kan uitvoeren in
1 seconde.
Betekenis kcat/Km
een maat voor de katalytische efficiëntie van een enzym
Bij lage [S] (veel lager dan Km) is dus
Onder deze voorwaarden is dat de snelheidsconstante voor het vormen
van een ES-complex. = katalytische efficiëntie/enzym efficiëntie.
