1: ALGEMEEN-APPARAT UUR-T ECHNI EKEN
INLEIDING
SAMENSTELLING VAN PERIFERE BLOED
- Opgebouwd uit cellen
- Opgelost in vloeistoffen
Witte bloedcellen
- Klassieke vorm 5 rijpe vormen aanwezig
- Soorten:
└ Basofiel
└ Neutrofiel
└ Eosinofiel
└ Lymfocyt
└ Monocyt
BELANGRIJK ONDERZOEK IN DE HEMATOLOGIE
- Anamnese en klinisch onderzoek van de patiënt
- Laboratoriumonderzoek van hematopoëtisch weefsel
└ Perifeer bloed: hier begint eerste onderzoek
└ Centrale organen: Beenmerg, klieren en andere hematopoëtische organen
- Onderzoek a.d.h.v.:
1. Eerstelijns analyse: volledige celanalyse en morfologische beoordeling
2. Tweedelijns analyse:
a. Immuunfenotypering (flowcytometrie)
b. Cytogenetica
c. Moleculaire diagnostie: FISH, PCR, NGS, WGS,…
- Medische beeldvorming
CELANALYSE VAN PERIFEER BLOED: COMPLET -FORMULE
Complet:
- Aantal aantal rbc / eenheid volume (liter)
- hemoglobinegehalte (g/dl)
- de hematocrietwaarde (% of l/l)
- aantal wbc / eenheid volume (liter)
- aantal bpl / eenheid volume (liter)
formule:
- differentiatie 100 wbc (%)
- morfologische afwijkingen bloedcellen
1
,HEMOCYTOMETRIE: CELANALYSE- COFO
Hematocytometrie = analysetechniek om verschillende soorten bloedcellen te identificeren en te tellen
+ concentratie hemoglobine meten
meetprincipe gebaseerd op verschil in
- celgrootte
- kernsamenstelling (mono vs polynucleair)
- cytoplasma samenstelling
- celmembraan samenstelling
verschillende celpopulaties worden geïdentificeerd in verschillende meetkanalen aan de hand van
verschillende meetprincipes:
- impedantie (direct current DC)
- radiogolven (radiofrequentie RF)
- optisch (lichtverstrooiing FSC (grootte) en SSC (complexiteit))
verschillende subpopulaties worden geïdentificeerd aan de hand van verschillende meetprincipes:
- kleuring (WBC)
└ Pox: peroxidase aantonen
└ Baso: basofiele kleuring
- fluorescentie (WBC, RET, normoblasten)
theoretische principes
- Hydrodynamische focussering met 2 vloeistofstromen:
└ Binnenste vloeistofstroom = verdunde celsuspensie
▪ In kegelvormige/conische kamer
▪ Verdund zodat je cel per cel kan analyseren, anders te veel cellen op elkaar
└ Buitenste vloeistofstroom = elektrolytenoplossing (seath vloeistof)
▪ Rond de conische kamer met een bepaalde snelheid
└ cellen worden door de seath vloeistof 1 voor 1 door een zeer smalle opening
(apertuur) geleid
- specifiek
└ impedantie = elektrisch met spanningsveld
└ lichtverstrooiing = optisch met lichtbundel
└ fluorescentie
└ radiogolven en detectoren
- eigenschappen van elke cel afzonderlijk meten = individuele celanalyse
2
,werking impedantie: (meting RBC en PLT)
1. elektrode aan beide zijden apertuur
2. stroom tussen elektroden (direct current)
3. cel passeert apertuur
4. weerstand tussen elektroden verandert
5. elektrische pulsverandering
aantal pulsen = aantal cellen
grootte puls ~ grootte cel
werking optisch:
- gebaseerd op lichtverstrooiing door specifieke eigenschappen van de cel
- cel = secundaire lichtbron
- cel gaat laserlicht verstrooiien
FSC forward scatter ~ grootte cel
SSC side scatter ~ complexiteit/granulariteit cel
- Meting van lymfocyten, monocyten en neutrofiele granulocyten (niet om cellen te tellen)
Werking fluorescentie:
- flowcytometrie
- fluorochroom gebonden aan antistoffen om CD-merkers aan te kleuren
- Cluster of Differentiation markers
- moleculen op het oppervlak van cellen die kenmerkend zijn voor een bepaald type cel
- Argon-ionen laser zendt licht uit (emissie)
- Fluorochromen worden actief en zenden licht uit met een bepaalde golflengte
- Cellen tellen en identificeren
Cellen meten = lichtverstrooiing
Cellen tellen = fluorescentie
3
,AUTOMATISCHE CELANALYZERS VAN PERIFEER BLOED
Parameters
VOLAUTOMATISCHE CELANALYSE: CELLEN TELLEN EN METEN
Meetkanalen:
1. Hb kanaal
2. RBC en PLT kanaal
3. RET(ic) kanaal
4. Perox kanaal
5. Baso kanaal
HB KANAAL:
- hemoglobine diluent:
└ zonder giftig cyanide CN
└ SLS natrium lauryl sulfaat
└ Dimethylaurylamine oxide : Stof die de werking van SLS ondersteunt
└ Buffer : pH 11.3-11.6
- Reactie:
└ SLS lyseert RBC
└ Hemoglobinde komt vrij
└ SLS bindt aan hemoglobine waardoor het verandert van structuur
└ Oxidatie van Fe2+ tot Fe3+
└ Fe3+ en SLS vormen een gekleurd complex
└ Spectrofotometrische bepaling (535 – 560 nm)
4
,RBC KANAAL:
- RBC moeten eerst in optimale conditie zijn (sferisch)
└ Cellen wassen en fixeren
└ De morfologisch afwijkende RBC blijven morfologisch afwijkend
- Optische meting
RBC Volume meten via lichtverstrooiing onder een hoek van 2-3°
Hb gehalte meten via lichtverstrooiing onder een hoek van 5-15°
PLT Zelfde kanaal als RBC
Opletten met rbc-fragmeten en rbc-inclusies (kunnen foutief als bloedplaatjes
geteld worden) = pseudo-trombocytose
- Tussen 1 & 2 + 3 & 4: normale concentratie hemoglobine/cel
- RBC histogram:
└ MCV: mean cell volume
5
,RET KANAAL:
- Fluorescentie door RNA (rijpe RBC hebben geen RNA)
- Hoe meer fluorescentie, hoe meer RNA, hoe jonger de reticulocyt
- Reticulocytenparameters om rijpheid te bepalen:
└ LFR = licht gekleurde reticulocyten (low fluorecence ratio)
└ MFR = normaal geleurde reticulocyten
└ HFR = sterk gekleurde reticulocyten
- Belang:
└ Indeling anemieën
└ Monitoring beenmergregeneratie
└ Opvolgen nierziekten en niertransplantatie
▪ Laag HFR en MFR kan wijzen op onvoldoende
EPO aanmaak
- Reticulocytenparameters voor volume en hemoglobine
└ MCVr = mean cell volume reticulocyte
└ CHr = mean reticulocyte cell hemoglobin
└ Belang:
▪ i.v. ijzertherapie
▪ EPO therapie
TELLEN VAN NORMOBLASTEN
- Worden geteld als WBC
- Oplossing: kleurstoffen die nucleïnezuren meten
POX EN BASO KANAAL
Pox kanaal : peroxidase activiteit Baso kanaal: basofiele kleuring
Substraat dat door myeoloperoxidase uit de Reagens dat degranulering van alle leukocyten
granulen wordt omgezet tot meetbare kleurstof veroorzaakt, behalve van basofiele granulocyten
Kleuren van neutrofiele en eosinofiele SSC signaal verlaagt door degranulering
granulocyten (bevatten peroxidase)
Behoudt basofielen, maar gaan alle andere WBC
Geen kleuring van lymfocyten (bevatten geen verteren zodat enkel kernen overblijven
peroxidase) = geen zwarte neerslag
Veel peroxidase activiteit: zwarte kleuring dat het
wit van de laser tegenhoudt
6
, - Zone 5:
└ Grotere lymfocyten tenzij dat je andere grote cellen
krijgt in het perifeer bloed
└ Dan mogelijks ziekte (blasten = kwaadaardig)
└ Geen basofielen want vallen samen met lymfocyten
WDF KANAAL = WHITE BLOOD CELL DIFFERENTIAL
- Differentiatie WBC met uitzondering van basofielen
- Lysercell WDF
└ Hemolyse (vernietigen RBC)
└ Penetratie WBC membraan
└ Doel: differentiatie van WBC obv grootte en compexiteit
- Fluorocell WDF
└ Fluorescerende kleurstof dringt WBC binnen
└ Kleuring nucleïnezuren en celorganellen
└ Fluorescentie-intensiteit afhankelijk van de hoeveelheid nucleïnezuren en celorganellen
└ Doel: differentiatie van WBC obv nucleïnezuren en celorganellen
WNR-KANAAL
- White Blood Cell, Basophil, and Normoblast Counting
- Differentiatie WBC, basofielen en normoblasten Lysercell WNR
└ Hemolyse RBC
└ Kleuring in WBC beter bewaard dan in normoblasten
└ Doel: tellen van WBC, basofielen en normoblasten
- Fluorocell WNR
└ Kleurt nucleïnezuren en celorganellen
└ Doel: differentiatie van WBC, basofielen en normoblasten
INDICATIES
- Volledige analyse normale bloedstalen
- Bepaling alle kwantitatieve afwijkingen: aantallen, concentraties
- Opsporen morfologische afwijkingen via flags
└ Niet alle gedetecteerde afwijkingen herkend (morfologische afwijkingen belang)
FLAGS
- Abnormale cellen in PB
- Afwijkingen RBC, WBC, BLP
- Artefacten
➔ Dus: microscopische controle
7
,VOORWAARDEN: VALIDATIE RESULTATEN
1. Ingangsverificatie bij aankoop en implementatie
2. Correcte kallibratie
3. Dagelijkse kwaliteitcontrole
a. Intern: firma (low – normal – high)
b. Patiëntenstalen
FOUTBRONNEN: ALGEMEEN
1. Foutieve bloedafname
2. Foutieve staalbewaring
3. Foutieve staalbehandeling
4. Foutieve kalibratie en onderhoud
5. Reagentiaproblemen
6. Interferenties
ALGEMENE PRINCIPES: MORFOLOGISCH ONDERZOEK
- Algemene celkenmerken
- Kenmerken van de celkern
- Kenmerken van het cytoplasma
- Kenmerken van de celrijping
Werkwijze:
1. Maken van een uitstrijkje
2. Kleuren van een uitstrijkje
3. Microscopisch onderzoek
Basofiel
- Basofiele granulocyt = in de WBC zitten donker/zwarte korrels aanwezig
- Basofiel = diep blauw cytoplasma om er op te wijzen dat het nog veel RNA bevat
Automatische microscoop
- WBC: herclassificatie
- RBC: prekarakterisatie & morfologische afwijkingen RBC/PLT
- Sign slide: resultaten confirmeren
8
, - Hemocytometer klassieke formule maken
- Mogelijkse flags genereren
- Belangrijk percentage van afwijkende bloedcellen
worden op het scherm weergegeven (niet meer
microscopie)
- Aanduiding van alle verschillende cellen
└ Gelobuleerde kern (neutrofiele
granulocyt) en GEEN monocyt
└ Schuiven naar juiste plaats op je scherm
└ Nieuwe waardeberekeningen
- Bij fouten: uitstrijkje aanmaak via microscoop
analyseren
AUTOMATISCHE HEMATOLOGIE CELANALYZERS
MORFOLOGISCH ONDERZOEK VAN ANDERE HEMATOPOËTISCHE ORGANEN
- hematopoëtische organen (wanneer resultaten bloed afwijkend waren): Klassieke onderzoeken
- Beenmergonderzoek
└ Beenmergaspiraat
└ Botbiopt
- Klieronderzoek
└ Klierpunctie
└ Klierbioptie
- Lichaamsvochten
FLOWCYTOMETRIE
Bestaat uit:
- Laserlicht en celstroom
- Monoclonale antilichamen
- Fluorochroom
└ Cellen meten = lichtverstrooiing
└ Cellen tellen = fluorescentie
9
INLEIDING
SAMENSTELLING VAN PERIFERE BLOED
- Opgebouwd uit cellen
- Opgelost in vloeistoffen
Witte bloedcellen
- Klassieke vorm 5 rijpe vormen aanwezig
- Soorten:
└ Basofiel
└ Neutrofiel
└ Eosinofiel
└ Lymfocyt
└ Monocyt
BELANGRIJK ONDERZOEK IN DE HEMATOLOGIE
- Anamnese en klinisch onderzoek van de patiënt
- Laboratoriumonderzoek van hematopoëtisch weefsel
└ Perifeer bloed: hier begint eerste onderzoek
└ Centrale organen: Beenmerg, klieren en andere hematopoëtische organen
- Onderzoek a.d.h.v.:
1. Eerstelijns analyse: volledige celanalyse en morfologische beoordeling
2. Tweedelijns analyse:
a. Immuunfenotypering (flowcytometrie)
b. Cytogenetica
c. Moleculaire diagnostie: FISH, PCR, NGS, WGS,…
- Medische beeldvorming
CELANALYSE VAN PERIFEER BLOED: COMPLET -FORMULE
Complet:
- Aantal aantal rbc / eenheid volume (liter)
- hemoglobinegehalte (g/dl)
- de hematocrietwaarde (% of l/l)
- aantal wbc / eenheid volume (liter)
- aantal bpl / eenheid volume (liter)
formule:
- differentiatie 100 wbc (%)
- morfologische afwijkingen bloedcellen
1
,HEMOCYTOMETRIE: CELANALYSE- COFO
Hematocytometrie = analysetechniek om verschillende soorten bloedcellen te identificeren en te tellen
+ concentratie hemoglobine meten
meetprincipe gebaseerd op verschil in
- celgrootte
- kernsamenstelling (mono vs polynucleair)
- cytoplasma samenstelling
- celmembraan samenstelling
verschillende celpopulaties worden geïdentificeerd in verschillende meetkanalen aan de hand van
verschillende meetprincipes:
- impedantie (direct current DC)
- radiogolven (radiofrequentie RF)
- optisch (lichtverstrooiing FSC (grootte) en SSC (complexiteit))
verschillende subpopulaties worden geïdentificeerd aan de hand van verschillende meetprincipes:
- kleuring (WBC)
└ Pox: peroxidase aantonen
└ Baso: basofiele kleuring
- fluorescentie (WBC, RET, normoblasten)
theoretische principes
- Hydrodynamische focussering met 2 vloeistofstromen:
└ Binnenste vloeistofstroom = verdunde celsuspensie
▪ In kegelvormige/conische kamer
▪ Verdund zodat je cel per cel kan analyseren, anders te veel cellen op elkaar
└ Buitenste vloeistofstroom = elektrolytenoplossing (seath vloeistof)
▪ Rond de conische kamer met een bepaalde snelheid
└ cellen worden door de seath vloeistof 1 voor 1 door een zeer smalle opening
(apertuur) geleid
- specifiek
└ impedantie = elektrisch met spanningsveld
└ lichtverstrooiing = optisch met lichtbundel
└ fluorescentie
└ radiogolven en detectoren
- eigenschappen van elke cel afzonderlijk meten = individuele celanalyse
2
,werking impedantie: (meting RBC en PLT)
1. elektrode aan beide zijden apertuur
2. stroom tussen elektroden (direct current)
3. cel passeert apertuur
4. weerstand tussen elektroden verandert
5. elektrische pulsverandering
aantal pulsen = aantal cellen
grootte puls ~ grootte cel
werking optisch:
- gebaseerd op lichtverstrooiing door specifieke eigenschappen van de cel
- cel = secundaire lichtbron
- cel gaat laserlicht verstrooiien
FSC forward scatter ~ grootte cel
SSC side scatter ~ complexiteit/granulariteit cel
- Meting van lymfocyten, monocyten en neutrofiele granulocyten (niet om cellen te tellen)
Werking fluorescentie:
- flowcytometrie
- fluorochroom gebonden aan antistoffen om CD-merkers aan te kleuren
- Cluster of Differentiation markers
- moleculen op het oppervlak van cellen die kenmerkend zijn voor een bepaald type cel
- Argon-ionen laser zendt licht uit (emissie)
- Fluorochromen worden actief en zenden licht uit met een bepaalde golflengte
- Cellen tellen en identificeren
Cellen meten = lichtverstrooiing
Cellen tellen = fluorescentie
3
,AUTOMATISCHE CELANALYZERS VAN PERIFEER BLOED
Parameters
VOLAUTOMATISCHE CELANALYSE: CELLEN TELLEN EN METEN
Meetkanalen:
1. Hb kanaal
2. RBC en PLT kanaal
3. RET(ic) kanaal
4. Perox kanaal
5. Baso kanaal
HB KANAAL:
- hemoglobine diluent:
└ zonder giftig cyanide CN
└ SLS natrium lauryl sulfaat
└ Dimethylaurylamine oxide : Stof die de werking van SLS ondersteunt
└ Buffer : pH 11.3-11.6
- Reactie:
└ SLS lyseert RBC
└ Hemoglobinde komt vrij
└ SLS bindt aan hemoglobine waardoor het verandert van structuur
└ Oxidatie van Fe2+ tot Fe3+
└ Fe3+ en SLS vormen een gekleurd complex
└ Spectrofotometrische bepaling (535 – 560 nm)
4
,RBC KANAAL:
- RBC moeten eerst in optimale conditie zijn (sferisch)
└ Cellen wassen en fixeren
└ De morfologisch afwijkende RBC blijven morfologisch afwijkend
- Optische meting
RBC Volume meten via lichtverstrooiing onder een hoek van 2-3°
Hb gehalte meten via lichtverstrooiing onder een hoek van 5-15°
PLT Zelfde kanaal als RBC
Opletten met rbc-fragmeten en rbc-inclusies (kunnen foutief als bloedplaatjes
geteld worden) = pseudo-trombocytose
- Tussen 1 & 2 + 3 & 4: normale concentratie hemoglobine/cel
- RBC histogram:
└ MCV: mean cell volume
5
,RET KANAAL:
- Fluorescentie door RNA (rijpe RBC hebben geen RNA)
- Hoe meer fluorescentie, hoe meer RNA, hoe jonger de reticulocyt
- Reticulocytenparameters om rijpheid te bepalen:
└ LFR = licht gekleurde reticulocyten (low fluorecence ratio)
└ MFR = normaal geleurde reticulocyten
└ HFR = sterk gekleurde reticulocyten
- Belang:
└ Indeling anemieën
└ Monitoring beenmergregeneratie
└ Opvolgen nierziekten en niertransplantatie
▪ Laag HFR en MFR kan wijzen op onvoldoende
EPO aanmaak
- Reticulocytenparameters voor volume en hemoglobine
└ MCVr = mean cell volume reticulocyte
└ CHr = mean reticulocyte cell hemoglobin
└ Belang:
▪ i.v. ijzertherapie
▪ EPO therapie
TELLEN VAN NORMOBLASTEN
- Worden geteld als WBC
- Oplossing: kleurstoffen die nucleïnezuren meten
POX EN BASO KANAAL
Pox kanaal : peroxidase activiteit Baso kanaal: basofiele kleuring
Substraat dat door myeoloperoxidase uit de Reagens dat degranulering van alle leukocyten
granulen wordt omgezet tot meetbare kleurstof veroorzaakt, behalve van basofiele granulocyten
Kleuren van neutrofiele en eosinofiele SSC signaal verlaagt door degranulering
granulocyten (bevatten peroxidase)
Behoudt basofielen, maar gaan alle andere WBC
Geen kleuring van lymfocyten (bevatten geen verteren zodat enkel kernen overblijven
peroxidase) = geen zwarte neerslag
Veel peroxidase activiteit: zwarte kleuring dat het
wit van de laser tegenhoudt
6
, - Zone 5:
└ Grotere lymfocyten tenzij dat je andere grote cellen
krijgt in het perifeer bloed
└ Dan mogelijks ziekte (blasten = kwaadaardig)
└ Geen basofielen want vallen samen met lymfocyten
WDF KANAAL = WHITE BLOOD CELL DIFFERENTIAL
- Differentiatie WBC met uitzondering van basofielen
- Lysercell WDF
└ Hemolyse (vernietigen RBC)
└ Penetratie WBC membraan
└ Doel: differentiatie van WBC obv grootte en compexiteit
- Fluorocell WDF
└ Fluorescerende kleurstof dringt WBC binnen
└ Kleuring nucleïnezuren en celorganellen
└ Fluorescentie-intensiteit afhankelijk van de hoeveelheid nucleïnezuren en celorganellen
└ Doel: differentiatie van WBC obv nucleïnezuren en celorganellen
WNR-KANAAL
- White Blood Cell, Basophil, and Normoblast Counting
- Differentiatie WBC, basofielen en normoblasten Lysercell WNR
└ Hemolyse RBC
└ Kleuring in WBC beter bewaard dan in normoblasten
└ Doel: tellen van WBC, basofielen en normoblasten
- Fluorocell WNR
└ Kleurt nucleïnezuren en celorganellen
└ Doel: differentiatie van WBC, basofielen en normoblasten
INDICATIES
- Volledige analyse normale bloedstalen
- Bepaling alle kwantitatieve afwijkingen: aantallen, concentraties
- Opsporen morfologische afwijkingen via flags
└ Niet alle gedetecteerde afwijkingen herkend (morfologische afwijkingen belang)
FLAGS
- Abnormale cellen in PB
- Afwijkingen RBC, WBC, BLP
- Artefacten
➔ Dus: microscopische controle
7
,VOORWAARDEN: VALIDATIE RESULTATEN
1. Ingangsverificatie bij aankoop en implementatie
2. Correcte kallibratie
3. Dagelijkse kwaliteitcontrole
a. Intern: firma (low – normal – high)
b. Patiëntenstalen
FOUTBRONNEN: ALGEMEEN
1. Foutieve bloedafname
2. Foutieve staalbewaring
3. Foutieve staalbehandeling
4. Foutieve kalibratie en onderhoud
5. Reagentiaproblemen
6. Interferenties
ALGEMENE PRINCIPES: MORFOLOGISCH ONDERZOEK
- Algemene celkenmerken
- Kenmerken van de celkern
- Kenmerken van het cytoplasma
- Kenmerken van de celrijping
Werkwijze:
1. Maken van een uitstrijkje
2. Kleuren van een uitstrijkje
3. Microscopisch onderzoek
Basofiel
- Basofiele granulocyt = in de WBC zitten donker/zwarte korrels aanwezig
- Basofiel = diep blauw cytoplasma om er op te wijzen dat het nog veel RNA bevat
Automatische microscoop
- WBC: herclassificatie
- RBC: prekarakterisatie & morfologische afwijkingen RBC/PLT
- Sign slide: resultaten confirmeren
8
, - Hemocytometer klassieke formule maken
- Mogelijkse flags genereren
- Belangrijk percentage van afwijkende bloedcellen
worden op het scherm weergegeven (niet meer
microscopie)
- Aanduiding van alle verschillende cellen
└ Gelobuleerde kern (neutrofiele
granulocyt) en GEEN monocyt
└ Schuiven naar juiste plaats op je scherm
└ Nieuwe waardeberekeningen
- Bij fouten: uitstrijkje aanmaak via microscoop
analyseren
AUTOMATISCHE HEMATOLOGIE CELANALYZERS
MORFOLOGISCH ONDERZOEK VAN ANDERE HEMATOPOËTISCHE ORGANEN
- hematopoëtische organen (wanneer resultaten bloed afwijkend waren): Klassieke onderzoeken
- Beenmergonderzoek
└ Beenmergaspiraat
└ Botbiopt
- Klieronderzoek
└ Klierpunctie
└ Klierbioptie
- Lichaamsvochten
FLOWCYTOMETRIE
Bestaat uit:
- Laserlicht en celstroom
- Monoclonale antilichamen
- Fluorochroom
└ Cellen meten = lichtverstrooiing
└ Cellen tellen = fluorescentie
9
