1. Basis van lichtmicroscopie
INTRODUCTIE
Waarom microscopie? Het oog is een variabele lens die onder verschillende condi6es een goed beeld kan vormen.
- Er is een variabele focus van de ooglens met geïnverteerde a>eelding.
- De iris is een circulair diafragma: opent en sluit om variabele hoeveelheid licht door te laten dat op de re6na valt.
Het oog heeA een hoge resolu6e door de grote hoeveelheid staa3es en kegeltjes en fotoreceptoren op de re8na met
gevoeligheid voor lichtsterkte en kleur. Ook zijn fotoreceptoren en zenuwcellen aanwezig die de info naar de hersenen brengen.
Er zijn echter verschillende limieten:
- Geen oneindige vergro6ngscapaciteit
- Beperkt onderscheidingsvermogen: gelimiteerde verfijndheid, detail
- De limiet van precisie van het oog ligt op ongeveer 0,1 mm (= resolu6e = scheidend vermogen)
Hoe oplossen? Lenzen laten toe om objecten groter te a>eelden = essen6e van microscopie.
- Geen nieuw concept: microscopen werden al gemaakt in de 16e eeuw
o Van Leeuwenhoek microscoop is zo goed door de lens die erin zit (dubbel bolvormig) die een object kan
vergroten dat op een pinnetje zit
o Beter: 2 lenzen. Dit is de essen6e van de moderne microscoop: combina6e van lenzen, vnl 2 lenzen om zo een
grotere vergro6ng mogelijk te maken
- De samengestelde microscopen (meer dan 1 lens) of compound microscopes
o Waren er vóór die met 1 lens: omgedraaide telescoop: holle buis met 2 lenzen
o Perfec6oneren à toonaangevend model gemaakt door Robert Hooke in 17e E
o Robert Hooke = grondlegger: maakte gedetailleerde waarnemingen v voorwerpen en documenteerde dit zeer
gedetailleerd. Bv. vlooien, luizen.
o In dit boek staat de eerste observa6e van bv een kurk: benoemde al cellen
Een microscoop is een instrument dat mogelijk maakt om kleine details zichtbaar te maken. 3 voornaamste taken:
1. Een vergroot beeld vormen van een specimen (vergro8ng)
2. Details in een beeld onderscheiden (resolu8e)
3. De details zichtbaar maken voor oog / camera / ander beeldvormingsapparaat (contrast)
GOLFEIGENSCHAPPEN VAN HET LICHT
SPECTRUM
Er is geen beeld als er geen licht is. Licht is een EM golf. EM golven zijn fluctua6es van elektrische en magne6sche velden, die in
staat zijn om energie te transporteren van de ene loca6e naar de andere. EM golven beva_en een wijd bereik aan mogelijke
stralingsvormingen met een verschil in golflengte (afstand tussen opeenvolgende pieken in het sinusoïdaal patroon).
Bij microscopie gebruikt men zichtbaar licht (400nm (violet) - 700 nm(rood)) (= slechts kleine frac6e van EM-spectrum)
Lagere golflengten = blauw, hogere golflengten (650-700) = dieprood. EM straling kan ook beschreven worden als een stroom
van fotonen: massaloze par6kels die zich voortbewegen aan lichtsnelheid.
- Golflengte (λ) is het omgekeerde van de frequen6e (Wet van Planck)
- Amplitude is de intensiteit
- Fase, polarisa6e: zijn de verschillende kenmerken van golven. λ is het belangrijkste.
1
,Als we licht beschouwen als golf zijn er een aantal kenmerken om microscopische beeldvorming te begrijpen.
Als een golf het einde van een medium bereikt zal reflec6e plaatsvinden vanaf de grens van het volgende medium, en er zal
transmissie plaatsvinden in het nieuwe medium. De golf ondergaat refrac6e (buigt) wanneer het de grens in een hoek bereikt.
Reflec6e, refrac6e en diffrac6e worden gekarakteriseerd door specifieke principes en wiskundige formules.
REFLECTIE
Alle golven ondergaan reflec6e wanneer ze een obstakel tegenkomen. Voor objecten met perfect gladde oppervlakten zal het
invallend licht volledig reflecteren = ‘specular’ reflec8on.
De hoek waarmee de golf een glad oppervlak bereikt, is gelijk aan de hoek waarmee de golf het oppervlak verlaat: θi = θr
De meeste objecten geven echter diffuse reflec8e, waarbij licht wordt gereflecteerd in alle rich6ngen. Dit gebeurt als de
onregelma6gheden op het oppervlak groter worden dan de golflengte van het invallend licht.
REFRACTIE (BREKING)
Als licht vanuit het ene in het andere medium beweegt, zal het vertragen of versnellen, akankelijk van het medium.
In vacuum heeA licht een bepaalde snelheid, in een ander medium zal de snelheid verhogen of verlagen.
Elk medium heeA een bepaalde brekingsindex (n). Hoe hoger deze brekingsindex, hoe trager het licht zich in dat medium
beweegt → licht vertraagt in een denser materiaal.
Als licht schuin invalt gebeurt breking van licht: refrac8e. Refrac6e is akankelijk van het medium waar het licht door gaat. De
refrac6eve index (n) is de ra6o vd snelheid van licht in vacuüm (c) gedeeld door de snelheid van licht in een medium (v): n = c / v
Hoe meer moleculen aanwezig zijn in het medium, hoe meer kans op botsing, hoe trager het licht zal gaan en dus hoe hoger de
brekingsindex. Als de brekingsindex hoger wordt, breekt het licht meer naar de normaal toe.
- Licht gaat naar denser medium à buigt af naar normaal toe
- Licht naar ijler medium à buigt af van normaal weg
𝐒𝐢𝐧 𝜽𝟏 𝒏𝟐
Hoe kleiner de brekingsindex, hoe groter de hoek = Wet van Snellius. 𝑺𝒊𝒏 𝜽𝟐 = 𝒏𝟏
- met θ = de hoek gemeten van de normaal van de grens
- n = de refrac6eve index
Dit is enkel als licht schuin wordt ingestuurd. Vanuit een bepaalde hoek zal ook
reflec6e optreden. In een kri8sche hoek: als θi = θr treedt enkel reflec6e op. De
inkomende en terugkaatsende hoek zijn dan even groot.
2
,Refrac6e is ook aNankelijk van de golflengte: blauw breekt harder dan rood. Als we wit licht
door een prisma sturen zal het opsplitsen in zijn kleuren: verschillende golflengten hebben dus
verschillende brekingshoeken (bij een kortere golflegte is er een sterkere breking (breking
omgekeerd evenredig met de golflengte)). Het concept van kleurakankelijke breking = dispersie.
DIFFRACTIE
Diffrac6e bepaalt de resolu6e van een microscoop. Diffrac6e vindt plaats als een golf een opening tegenkomt die kleiner is dan
de eigen golflengte. Er ontstaat een soort sferische golf die begint uit te spreiden. Dit is prominenter bij een kleinere opening.
- Wanneer de golflengte kleiner is dan de apertuur opening (d), zal de golf gewoon verder reizen in een rechte lijn.
+
- Wanneer de golflengte groter is dan de opening, gebeurt diffrac6e volgens de formule: sin 𝜃 = ,
Een centraal maximum met daarnaast ripple phenomenom: secundaire maxima met verminderende intensiteit.
De piekjes ontstaan door een tweede fenomeen dat makkelijker wordt beschreven door 2 sferische golven.
Er zal interferen8e ontstaan tussen verschillende delen van de golf (2 golffronten komen tegen elkaar):
- Construc8eve interferen6e à versterken elkaar à hogere golf à golven in fase, verschuiving van n keer golflengten
- Destruc8eve interferen6e: doven elkaar uit (waar 2 dallen elkaar ontmoeten) à vlakken elkaar uit à golven uit fase,
verschuiving is van n keer een halve gollengten
Dit geldt enkel voor pieken die even groot zijn! Dit treedt dus ook op als licht door een zeer kleine opening wordt gestuurd:
interferen6e van de eigen golven die met elkaar interfereren. De hoek waaronder de verstrooiing/buiging gebeurt is akankelijk
van de golflengte en de groo_e van de opening. Hoe kleiner de opening hoe groter de hoek.
MICROSCOOP OPTICA
LENS THEORIE
Dit vertelt ons hoe licht doorheen een lens zal gaan. Stel een dubbel convexe lens met beide zijden perfect bolvormig.
Er vormt dan een focaal punt van de lens (punt waar licht in de focus van de lens komt, waar het geconcentreerd wordt):
1. Parallele stralen convergeren naar (worden gefocusseerd) het focale punt
2. Licht dat vertrekt vanuit het focale punt, zal perfect parallel uitschijnen
3. Stralen die doorheen het centrum van de lens gaan, blijven onveranderd (licht zal niet gebroken worden) (echt beeld ligt
aan de andere kant van de lens)
3
, VERGROTING (MAGNIFICATION)
Obv deze 3 lijnen kan je tekenen/uitrekenen waar het object zal staan
- Parallelle lijn met de op6sche as die a>uigt doorheen het focaal punt
- 2e lijn die doorheen het focaal punt (= focal point (f)) gaat, en achter de lens parallel uitschijnt
- 3e lijn door het midden van de lens, die achter de lens ongehinderd voortbeweegt
We kunnen voorspellen waar het voorwerp zich bevindt en hoe groot het eal zijn als we d0,h0 en f kennen.
- De afstand van een beeld van de lens (di) is nl. direct gerelateerd aan de afstand van het object tot de lens (do) en de
- - -
focale afstand (f) door de lens maker equa,on: + =
,. ,/ 0
- De laterale vergro6ng (M) vd lens, m.a.w. de ra6o van de hoogte van het beeld (hi) en de hoogte van het object (ho) zijn
,/ 1/
gerelateerd aan hun resp. afstanden door de Magnifica,on formule: 𝑀 = − ,. =
1.
Voor werkelijke beelden is M nega6ef en is het beeld geïnverteerd. Een werkelijk beeld wordt gevormd als het object verder weg
staat dan de focale lengte.
Voor virtuele beelden is M posi6ef en is het beeld recht. Een virtueel beeld als het object dichter staat dan de focale lengte.
- Stel d0 = 3f à di = 3/2 f (1,5 f) M = -1/2 à geïnverteerd en verkleind (reëel)
- Stel d0 = 3/2f à di = 3f M = -2 à geïnverteerd en vergroot (reëel)
- Stel d0 = f/2 à di = -f M=2 à virtueel beeld, vergroot, rechtopstaand
- Stel d0 = 2f à geïnverteerd en evengroot (reëel)
f< d0 < 2f, bv. d0 = 3f/2
d0 > 2f, bv. d0 = 3f
d0 < f, bv. f/2 d0 = 2f
4
INTRODUCTIE
Waarom microscopie? Het oog is een variabele lens die onder verschillende condi6es een goed beeld kan vormen.
- Er is een variabele focus van de ooglens met geïnverteerde a>eelding.
- De iris is een circulair diafragma: opent en sluit om variabele hoeveelheid licht door te laten dat op de re6na valt.
Het oog heeA een hoge resolu6e door de grote hoeveelheid staa3es en kegeltjes en fotoreceptoren op de re8na met
gevoeligheid voor lichtsterkte en kleur. Ook zijn fotoreceptoren en zenuwcellen aanwezig die de info naar de hersenen brengen.
Er zijn echter verschillende limieten:
- Geen oneindige vergro6ngscapaciteit
- Beperkt onderscheidingsvermogen: gelimiteerde verfijndheid, detail
- De limiet van precisie van het oog ligt op ongeveer 0,1 mm (= resolu6e = scheidend vermogen)
Hoe oplossen? Lenzen laten toe om objecten groter te a>eelden = essen6e van microscopie.
- Geen nieuw concept: microscopen werden al gemaakt in de 16e eeuw
o Van Leeuwenhoek microscoop is zo goed door de lens die erin zit (dubbel bolvormig) die een object kan
vergroten dat op een pinnetje zit
o Beter: 2 lenzen. Dit is de essen6e van de moderne microscoop: combina6e van lenzen, vnl 2 lenzen om zo een
grotere vergro6ng mogelijk te maken
- De samengestelde microscopen (meer dan 1 lens) of compound microscopes
o Waren er vóór die met 1 lens: omgedraaide telescoop: holle buis met 2 lenzen
o Perfec6oneren à toonaangevend model gemaakt door Robert Hooke in 17e E
o Robert Hooke = grondlegger: maakte gedetailleerde waarnemingen v voorwerpen en documenteerde dit zeer
gedetailleerd. Bv. vlooien, luizen.
o In dit boek staat de eerste observa6e van bv een kurk: benoemde al cellen
Een microscoop is een instrument dat mogelijk maakt om kleine details zichtbaar te maken. 3 voornaamste taken:
1. Een vergroot beeld vormen van een specimen (vergro8ng)
2. Details in een beeld onderscheiden (resolu8e)
3. De details zichtbaar maken voor oog / camera / ander beeldvormingsapparaat (contrast)
GOLFEIGENSCHAPPEN VAN HET LICHT
SPECTRUM
Er is geen beeld als er geen licht is. Licht is een EM golf. EM golven zijn fluctua6es van elektrische en magne6sche velden, die in
staat zijn om energie te transporteren van de ene loca6e naar de andere. EM golven beva_en een wijd bereik aan mogelijke
stralingsvormingen met een verschil in golflengte (afstand tussen opeenvolgende pieken in het sinusoïdaal patroon).
Bij microscopie gebruikt men zichtbaar licht (400nm (violet) - 700 nm(rood)) (= slechts kleine frac6e van EM-spectrum)
Lagere golflengten = blauw, hogere golflengten (650-700) = dieprood. EM straling kan ook beschreven worden als een stroom
van fotonen: massaloze par6kels die zich voortbewegen aan lichtsnelheid.
- Golflengte (λ) is het omgekeerde van de frequen6e (Wet van Planck)
- Amplitude is de intensiteit
- Fase, polarisa6e: zijn de verschillende kenmerken van golven. λ is het belangrijkste.
1
,Als we licht beschouwen als golf zijn er een aantal kenmerken om microscopische beeldvorming te begrijpen.
Als een golf het einde van een medium bereikt zal reflec6e plaatsvinden vanaf de grens van het volgende medium, en er zal
transmissie plaatsvinden in het nieuwe medium. De golf ondergaat refrac6e (buigt) wanneer het de grens in een hoek bereikt.
Reflec6e, refrac6e en diffrac6e worden gekarakteriseerd door specifieke principes en wiskundige formules.
REFLECTIE
Alle golven ondergaan reflec6e wanneer ze een obstakel tegenkomen. Voor objecten met perfect gladde oppervlakten zal het
invallend licht volledig reflecteren = ‘specular’ reflec8on.
De hoek waarmee de golf een glad oppervlak bereikt, is gelijk aan de hoek waarmee de golf het oppervlak verlaat: θi = θr
De meeste objecten geven echter diffuse reflec8e, waarbij licht wordt gereflecteerd in alle rich6ngen. Dit gebeurt als de
onregelma6gheden op het oppervlak groter worden dan de golflengte van het invallend licht.
REFRACTIE (BREKING)
Als licht vanuit het ene in het andere medium beweegt, zal het vertragen of versnellen, akankelijk van het medium.
In vacuum heeA licht een bepaalde snelheid, in een ander medium zal de snelheid verhogen of verlagen.
Elk medium heeA een bepaalde brekingsindex (n). Hoe hoger deze brekingsindex, hoe trager het licht zich in dat medium
beweegt → licht vertraagt in een denser materiaal.
Als licht schuin invalt gebeurt breking van licht: refrac8e. Refrac6e is akankelijk van het medium waar het licht door gaat. De
refrac6eve index (n) is de ra6o vd snelheid van licht in vacuüm (c) gedeeld door de snelheid van licht in een medium (v): n = c / v
Hoe meer moleculen aanwezig zijn in het medium, hoe meer kans op botsing, hoe trager het licht zal gaan en dus hoe hoger de
brekingsindex. Als de brekingsindex hoger wordt, breekt het licht meer naar de normaal toe.
- Licht gaat naar denser medium à buigt af naar normaal toe
- Licht naar ijler medium à buigt af van normaal weg
𝐒𝐢𝐧 𝜽𝟏 𝒏𝟐
Hoe kleiner de brekingsindex, hoe groter de hoek = Wet van Snellius. 𝑺𝒊𝒏 𝜽𝟐 = 𝒏𝟏
- met θ = de hoek gemeten van de normaal van de grens
- n = de refrac6eve index
Dit is enkel als licht schuin wordt ingestuurd. Vanuit een bepaalde hoek zal ook
reflec6e optreden. In een kri8sche hoek: als θi = θr treedt enkel reflec6e op. De
inkomende en terugkaatsende hoek zijn dan even groot.
2
,Refrac6e is ook aNankelijk van de golflengte: blauw breekt harder dan rood. Als we wit licht
door een prisma sturen zal het opsplitsen in zijn kleuren: verschillende golflengten hebben dus
verschillende brekingshoeken (bij een kortere golflegte is er een sterkere breking (breking
omgekeerd evenredig met de golflengte)). Het concept van kleurakankelijke breking = dispersie.
DIFFRACTIE
Diffrac6e bepaalt de resolu6e van een microscoop. Diffrac6e vindt plaats als een golf een opening tegenkomt die kleiner is dan
de eigen golflengte. Er ontstaat een soort sferische golf die begint uit te spreiden. Dit is prominenter bij een kleinere opening.
- Wanneer de golflengte kleiner is dan de apertuur opening (d), zal de golf gewoon verder reizen in een rechte lijn.
+
- Wanneer de golflengte groter is dan de opening, gebeurt diffrac6e volgens de formule: sin 𝜃 = ,
Een centraal maximum met daarnaast ripple phenomenom: secundaire maxima met verminderende intensiteit.
De piekjes ontstaan door een tweede fenomeen dat makkelijker wordt beschreven door 2 sferische golven.
Er zal interferen8e ontstaan tussen verschillende delen van de golf (2 golffronten komen tegen elkaar):
- Construc8eve interferen6e à versterken elkaar à hogere golf à golven in fase, verschuiving van n keer golflengten
- Destruc8eve interferen6e: doven elkaar uit (waar 2 dallen elkaar ontmoeten) à vlakken elkaar uit à golven uit fase,
verschuiving is van n keer een halve gollengten
Dit geldt enkel voor pieken die even groot zijn! Dit treedt dus ook op als licht door een zeer kleine opening wordt gestuurd:
interferen6e van de eigen golven die met elkaar interfereren. De hoek waaronder de verstrooiing/buiging gebeurt is akankelijk
van de golflengte en de groo_e van de opening. Hoe kleiner de opening hoe groter de hoek.
MICROSCOOP OPTICA
LENS THEORIE
Dit vertelt ons hoe licht doorheen een lens zal gaan. Stel een dubbel convexe lens met beide zijden perfect bolvormig.
Er vormt dan een focaal punt van de lens (punt waar licht in de focus van de lens komt, waar het geconcentreerd wordt):
1. Parallele stralen convergeren naar (worden gefocusseerd) het focale punt
2. Licht dat vertrekt vanuit het focale punt, zal perfect parallel uitschijnen
3. Stralen die doorheen het centrum van de lens gaan, blijven onveranderd (licht zal niet gebroken worden) (echt beeld ligt
aan de andere kant van de lens)
3
, VERGROTING (MAGNIFICATION)
Obv deze 3 lijnen kan je tekenen/uitrekenen waar het object zal staan
- Parallelle lijn met de op6sche as die a>uigt doorheen het focaal punt
- 2e lijn die doorheen het focaal punt (= focal point (f)) gaat, en achter de lens parallel uitschijnt
- 3e lijn door het midden van de lens, die achter de lens ongehinderd voortbeweegt
We kunnen voorspellen waar het voorwerp zich bevindt en hoe groot het eal zijn als we d0,h0 en f kennen.
- De afstand van een beeld van de lens (di) is nl. direct gerelateerd aan de afstand van het object tot de lens (do) en de
- - -
focale afstand (f) door de lens maker equa,on: + =
,. ,/ 0
- De laterale vergro6ng (M) vd lens, m.a.w. de ra6o van de hoogte van het beeld (hi) en de hoogte van het object (ho) zijn
,/ 1/
gerelateerd aan hun resp. afstanden door de Magnifica,on formule: 𝑀 = − ,. =
1.
Voor werkelijke beelden is M nega6ef en is het beeld geïnverteerd. Een werkelijk beeld wordt gevormd als het object verder weg
staat dan de focale lengte.
Voor virtuele beelden is M posi6ef en is het beeld recht. Een virtueel beeld als het object dichter staat dan de focale lengte.
- Stel d0 = 3f à di = 3/2 f (1,5 f) M = -1/2 à geïnverteerd en verkleind (reëel)
- Stel d0 = 3/2f à di = 3f M = -2 à geïnverteerd en vergroot (reëel)
- Stel d0 = f/2 à di = -f M=2 à virtueel beeld, vergroot, rechtopstaand
- Stel d0 = 2f à geïnverteerd en evengroot (reëel)
f< d0 < 2f, bv. d0 = 3f/2
d0 > 2f, bv. d0 = 3f
d0 < f, bv. f/2 d0 = 2f
4
