2de Bach. BMW Analytische
Biochemie 1
Door Zeno De Paus
,Zeno De Paus Analytische biochemie 1 2de Bach. BMW
Inhoud
Hoofdstuk 1: Inleiding tot analytische biochemie .......................................................................................... 3
Design van een biochemisch experiment .......................................................................................................... 4
Meeteenheden en concentraties ............................................................................................................................ 5
Theorie ........................................................................................................................................................................ 5
Uitgewerkte oefeningen ....................................................................................................................................... 6
Elektrolyten.................................................................................................................................................................... 7
Activiteit en activiteitscoëfficiënt.......................................................................................................................... 8
Hoofdstuk 2: Celcultuur en celfractionatie ....................................................................................................... 8
Inleiding ........................................................................................................................................................................... 8
Basisapparatuur ........................................................................................................................................................ 10
Recipiënten ............................................................................................................................................................. 10
Laminaire flow ...................................................................................................................................................... 11
Incubator ................................................................................................................................................................. 12
Groeivoorwaarden.................................................................................................................................................... 12
Groeikinetiek .............................................................................................................................................................. 13
Toepassingen .............................................................................................................................................................. 13
Invriezen van cellen (= cryopreservatie) ....................................................................................................... 17
Celtelling ....................................................................................................................................................................... 18
Celfractionatie ............................................................................................................................................................ 19
Zuiveren van cellen.............................................................................................................................................. 19
Zuiveren van celorganellen .............................................................................................................................. 22
Hoofdstuk 3: Filtratie en precipitatie .............................................................................................................. 23
Filtratie.......................................................................................................................................................................... 23
Dieptefiltratie ........................................................................................................................................................ 23
Membraanfilters ................................................................................................................................................... 23
Dialyse ........................................................................................................................................................................... 25
Ultrafiltratie ................................................................................................................................................................ 26
Kort overzicht van de verschillende methoden............................................................................................ 27
De precipitatie (= neerslag) van eiwitten ...................................................................................................... 28
Precipitatie door uitzouten .............................................................................................................................. 28
Isoëlektrisch precipitatie .................................................................................................................................. 30
Precipitatie in organische solventen ............................................................................................................ 30
Immunoprecipitatie ............................................................................................................................................ 30
1
,Zeno De Paus Analytische biochemie 1 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 4: Centrifugatie .................................................................................................................................. 31
Introductie en fysische principes ....................................................................................................................... 31
Instrumenten .............................................................................................................................................................. 32
Soorten centrifugatie............................................................................................................................................... 33
Differentiële centrifugatie ................................................................................................................................ 33
Dichtheidsgradiënt centrifugatie ....................................................................................................................... 34
Sedimentatie ............................................................................................................................................................... 35
Hoofdstuk 5: Chromatografie ............................................................................................................................. 36
Theoretische beschrijving van chromatografie ............................................................................................ 36
Indeling van de chromatografische methoden ............................................................................................. 42
Kolomchromatografie ........................................................................................................................................ 42
Ionenuitwisselingschromatografie als soort kolomchromatografie............................................... 44
Gelfiltratie of moleculaire zeefchromatografie of gelpermeatie als soort
kolomchromatografie ......................................................................................................................................... 44
Hydrofobe chromatografie als soort kolomchromatografie............................................................... 45
Affiniteitschromatografie als soort kolomchromatografie ................................................................. 45
Gaschromatografie (GC) als soort kolomchromatografie ................................................................... 46
Dunnelaagchromatografie als soort kolomchromatografie ............................................................... 46
Overzicht: toepassingen van de soorten chromatografie .................................................................... 47
Hoofdstuk 6: Elektroforese ................................................................................................................................. 48
Principes van elektroforese .................................................................................................................................. 48
Dunne laag elektroforese....................................................................................................................................... 50
Gel elektroforese ....................................................................................................................................................... 50
Agarose gel elektroforese ................................................................................................................................. 50
Polyacrylamide gel elektroforese .................................................................................................................. 52
Iso-elektrofocusing (IEF) en 2D-PAGE............................................................................................................. 56
Downstream applicaties ........................................................................................................................................ 57
Western blotting ................................................................................................................................................... 57
Southern en Northern blotting ....................................................................................................................... 57
Capillaire elektroforese .......................................................................................................................................... 58
2
, Zeno De Paus Analytische biochemie 1 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 1: Inleiding tot analytische biochemie
Wat is de biochemie? Geef enkele voorbeelden.
De biochemie is de studie van chemische processen (= chemie) in levende organismen (=
biologie) met als doel het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de cel. Enkele
voorbeelden zijn:
• Wat zijn de structurele, kinetische en thermodynamische eigenschappen van moleculen
in een levend organismen?
• Wat is de functie van een moleculen en hoe werken ze samen met andere moleculen in
een levend organismen?
• Welke pathways zijn verantwoordelijk voor de synthesen en degradatie van bepaalde
moleculen in een levend organismen?
• …
Welke technieken en overwegingen zijn belangrijk voor een biochemische analyse?
Als men een bepaald experiment willen uitvoeren, moeten we rekeninghouden met volgende
stappen:
1. Hoe gaan we ons staal voorbereiden? → Massaspectrometrie, Western blotting, …
2. Hoe gaan we de biocomponenten waarin we geïnteresseerd zijn zuiveren en isoleren uit
een gegeven staal? → Enzym-assays (activiteit), Röntgenkristallografie (structuur), …
3. Hoe identificeren1, karakteriseren1 en kwantificeren1 we deze biocomponenten
→ Spectrofotometrie (Zoals Bradford-assay), qPCR, ELISA, …
Nu moet men overwegen of het experiment in vivo of in vitro gebeurd:
• In vitro → We doel het onderzoek in eenvoudige celmodellen zodat de resultaten
gemakkelijker te interpreteren zijn, deze zullen echter minder overeenkomen met de
fysiologische situatie
• In vivo → Oftewel in het levend systeem, hier heb je alle parametrisch die in een
normaal lichaam aanwezig zijn. Echter moet je rekening houden met immens veel
parameters, waardoor meteen in vivo werken moeilijker is
1Identificeren = ‘Welke moleculen is het’ ; Karakteriseren = ‘Wat is de functie van deze biocomponenten’ ; Kwantificeren = ‘Hoeveel
van deze biocomponenten hebben we’
3
Biochemie 1
Door Zeno De Paus
,Zeno De Paus Analytische biochemie 1 2de Bach. BMW
Inhoud
Hoofdstuk 1: Inleiding tot analytische biochemie .......................................................................................... 3
Design van een biochemisch experiment .......................................................................................................... 4
Meeteenheden en concentraties ............................................................................................................................ 5
Theorie ........................................................................................................................................................................ 5
Uitgewerkte oefeningen ....................................................................................................................................... 6
Elektrolyten.................................................................................................................................................................... 7
Activiteit en activiteitscoëfficiënt.......................................................................................................................... 8
Hoofdstuk 2: Celcultuur en celfractionatie ....................................................................................................... 8
Inleiding ........................................................................................................................................................................... 8
Basisapparatuur ........................................................................................................................................................ 10
Recipiënten ............................................................................................................................................................. 10
Laminaire flow ...................................................................................................................................................... 11
Incubator ................................................................................................................................................................. 12
Groeivoorwaarden.................................................................................................................................................... 12
Groeikinetiek .............................................................................................................................................................. 13
Toepassingen .............................................................................................................................................................. 13
Invriezen van cellen (= cryopreservatie) ....................................................................................................... 17
Celtelling ....................................................................................................................................................................... 18
Celfractionatie ............................................................................................................................................................ 19
Zuiveren van cellen.............................................................................................................................................. 19
Zuiveren van celorganellen .............................................................................................................................. 22
Hoofdstuk 3: Filtratie en precipitatie .............................................................................................................. 23
Filtratie.......................................................................................................................................................................... 23
Dieptefiltratie ........................................................................................................................................................ 23
Membraanfilters ................................................................................................................................................... 23
Dialyse ........................................................................................................................................................................... 25
Ultrafiltratie ................................................................................................................................................................ 26
Kort overzicht van de verschillende methoden............................................................................................ 27
De precipitatie (= neerslag) van eiwitten ...................................................................................................... 28
Precipitatie door uitzouten .............................................................................................................................. 28
Isoëlektrisch precipitatie .................................................................................................................................. 30
Precipitatie in organische solventen ............................................................................................................ 30
Immunoprecipitatie ............................................................................................................................................ 30
1
,Zeno De Paus Analytische biochemie 1 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 4: Centrifugatie .................................................................................................................................. 31
Introductie en fysische principes ....................................................................................................................... 31
Instrumenten .............................................................................................................................................................. 32
Soorten centrifugatie............................................................................................................................................... 33
Differentiële centrifugatie ................................................................................................................................ 33
Dichtheidsgradiënt centrifugatie ....................................................................................................................... 34
Sedimentatie ............................................................................................................................................................... 35
Hoofdstuk 5: Chromatografie ............................................................................................................................. 36
Theoretische beschrijving van chromatografie ............................................................................................ 36
Indeling van de chromatografische methoden ............................................................................................. 42
Kolomchromatografie ........................................................................................................................................ 42
Ionenuitwisselingschromatografie als soort kolomchromatografie............................................... 44
Gelfiltratie of moleculaire zeefchromatografie of gelpermeatie als soort
kolomchromatografie ......................................................................................................................................... 44
Hydrofobe chromatografie als soort kolomchromatografie............................................................... 45
Affiniteitschromatografie als soort kolomchromatografie ................................................................. 45
Gaschromatografie (GC) als soort kolomchromatografie ................................................................... 46
Dunnelaagchromatografie als soort kolomchromatografie ............................................................... 46
Overzicht: toepassingen van de soorten chromatografie .................................................................... 47
Hoofdstuk 6: Elektroforese ................................................................................................................................. 48
Principes van elektroforese .................................................................................................................................. 48
Dunne laag elektroforese....................................................................................................................................... 50
Gel elektroforese ....................................................................................................................................................... 50
Agarose gel elektroforese ................................................................................................................................. 50
Polyacrylamide gel elektroforese .................................................................................................................. 52
Iso-elektrofocusing (IEF) en 2D-PAGE............................................................................................................. 56
Downstream applicaties ........................................................................................................................................ 57
Western blotting ................................................................................................................................................... 57
Southern en Northern blotting ....................................................................................................................... 57
Capillaire elektroforese .......................................................................................................................................... 58
2
, Zeno De Paus Analytische biochemie 1 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 1: Inleiding tot analytische biochemie
Wat is de biochemie? Geef enkele voorbeelden.
De biochemie is de studie van chemische processen (= chemie) in levende organismen (=
biologie) met als doel het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de cel. Enkele
voorbeelden zijn:
• Wat zijn de structurele, kinetische en thermodynamische eigenschappen van moleculen
in een levend organismen?
• Wat is de functie van een moleculen en hoe werken ze samen met andere moleculen in
een levend organismen?
• Welke pathways zijn verantwoordelijk voor de synthesen en degradatie van bepaalde
moleculen in een levend organismen?
• …
Welke technieken en overwegingen zijn belangrijk voor een biochemische analyse?
Als men een bepaald experiment willen uitvoeren, moeten we rekeninghouden met volgende
stappen:
1. Hoe gaan we ons staal voorbereiden? → Massaspectrometrie, Western blotting, …
2. Hoe gaan we de biocomponenten waarin we geïnteresseerd zijn zuiveren en isoleren uit
een gegeven staal? → Enzym-assays (activiteit), Röntgenkristallografie (structuur), …
3. Hoe identificeren1, karakteriseren1 en kwantificeren1 we deze biocomponenten
→ Spectrofotometrie (Zoals Bradford-assay), qPCR, ELISA, …
Nu moet men overwegen of het experiment in vivo of in vitro gebeurd:
• In vitro → We doel het onderzoek in eenvoudige celmodellen zodat de resultaten
gemakkelijker te interpreteren zijn, deze zullen echter minder overeenkomen met de
fysiologische situatie
• In vivo → Oftewel in het levend systeem, hier heb je alle parametrisch die in een
normaal lichaam aanwezig zijn. Echter moet je rekening houden met immens veel
parameters, waardoor meteen in vivo werken moeilijker is
1Identificeren = ‘Welke moleculen is het’ ; Karakteriseren = ‘Wat is de functie van deze biocomponenten’ ; Kwantificeren = ‘Hoeveel
van deze biocomponenten hebben we’
3
