2de Bach. BMW Analytische
Biochemie II
Door Zeno De Paus
,Zeno De Paus Analytische biochemie II 2de Bach. BMW
Inhoud
Hoofdstuk 1: Analytische performantie, kwaliteitscontrole en kalibratie ..................................................................3
Analytische performantie ................................................................................................................................................................3
Kwaliteitscontrole ...............................................................................................................................................................................5
Kalibratie van de biochemische analyse....................................................................................................................................5
Externe kalibratie...........................................................................................................................................................................6
Interne kalibratie ...........................................................................................................................................................................7
Verschillende fasen en fouten van de biochemische analyse ...........................................................................................8
Hoofdstuk 2: Radio-isotopen ......................................................................................................................................................9
Radioactiviteit: inleiding ..................................................................................................................................................................9
Detectie en meting van radioactiviteit .................................................................................................................................... 12
Hoofdstuk 3: Elektrochemie en biosensoren ..................................................................................................................... 14
Elektrochemie .................................................................................................................................................................................... 14
Inleiding .......................................................................................................................................................................................... 14
Het potentiaal tussen metalen en oplossingen .............................................................................................................. 16
Elektrochemische cellen .......................................................................................................................................................... 17
Analytische methoden .............................................................................................................................................................. 18
Biosensoren ........................................................................................................................................................................................ 20
1
,Zeno De Paus Analytische biochemie II 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 4: Spectrometrische analysemethoden........................................................................................................... 21
Inleiding ................................................................................................................................................................................................ 21
Het elektromagnetisch spectrum (EM-spectrum) ....................................................................................................... 22
Molecuul- en atoomspectra .................................................................................................................................................... 23
Moleculair: UV-VIS............................................................................................................................................................................ 24
Algemeen principe ...................................................................................................................................................................... 24
Onderdelen van de spectrofotometer ................................................................................................................................ 25
Controle van de werking van een spectrofotometer ................................................................................................... 26
Moleculair: IR (InfraRood) ........................................................................................................................................................... 27
Fysische principes ....................................................................................................................................................................... 27
Het IR-spectrogram .................................................................................................................................................................... 28
Moleculair: Fluorimetrie ............................................................................................................................................................... 29
Fysische principes ....................................................................................................................................................................... 29
Opbouw ........................................................................................................................................................................................... 30
Intensiteit van de fluorescentie ............................................................................................................................................ 31
Suspensie: turbidimetrie, nefelometrie en refractometrie ............................................................................................ 32
Moleculair: NMR-spectrometrie ................................................................................................................................................ 33
Inleiding .......................................................................................................................................................................................... 33
Het 1H NMR spectrum .............................................................................................................................................................. 34
Het 13C NMR spectrum ............................................................................................................................................................ 36
Atoomspectrofotometrie ............................................................................................................................................................... 38
Atomair: FAAS en ETAAS .......................................................................................................................................................... 38
Atomair: Vlamfotometrie ......................................................................................................................................................... 39
Atomair: Inductief gekoppelde plasma emissie spectrometrie (ICPES) ............................................................ 40
Massaspectrometrie ........................................................................................................................................................................ 41
Inleiding .......................................................................................................................................................................................... 41
Ionisatie ........................................................................................................................................................................................... 41
Massa analyse ............................................................................................................................................................................... 42
Detector en tandem .................................................................................................................................................................... 43
Peptidefragmentatie en spectra............................................................................................................................................ 44
Hoofdstuk 5: Analyse van biomoleculen in praktijk ........................................................................................................ 46
Morfologische analyse .................................................................................................................................................................... 46
Biochemische / enzymatische analyse ................................................................................................................................... 47
2
, Zeno De Paus Analytische biochemie II 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 1: Analytische performantie,
kwaliteitscontrole en kalibratie
Analytische performantie
Bespreek het verschil tussen een kwalitatieve en een kwantitatieve analyse. Hoe meten we deze?
Voor biochemisch onderzoek kun je zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses uitvoeren:
• Kwalitatieve analyse → We onderzoeken of een bepaald moleculen aanwezig is in een
bepaald staal
• Kwantitatieve analyse → We onderzoeken de relatieve hoeveelheid moleculen die
aanwezig zijn in een bepaal staal
o Partiële analyse: Je analyseert de relatieve hoeveelheid van enkele moleculen in
het staal
o Totaalanalyse: Je analyseert de relatieve hoeveelheid van alle moleculen in het
staal
o Individuele analyse: Je onderzoekt één component, bijvoorbeeld het
glucosegehalte in het bloed
o Groepsanalyse: Je onderzoekt een aantal verwante componenten, bijvoorbeeld
het suikergehalte in het bloed
Deze soorten analyses berusten op metingen van een fysische of fysicochemische grootheid die
recht of omgekeerd evenredig is met de hoeveelheid staal aanwezig. Voorbeelden zijn
stroomsterkte, massa, radioactiviteit, lichtabsorptie, fluorescentie, enzovoort
Bespreek de parameters ‘specificiteit’, ‘selectiviteit’, en‘ sensitiviteit’, met betrekking tot
biochemisch onderzoek
Voor biochemisch onderzoek moet men altijd nagaan of de specificiteit en selectiviteit in orde is:
• Specificiteit: Een reactie is specifiek als het enkel het gewenste bestanddeel detecteert
• Selectiviteit: Een test is selectief wanneer hij het gewenste bestanddeel detecteerd, maar
eventueel ook andere bestanddelen kan detecteren. De selectiviteit kan worden
aangepast door enkele parameters zoals de pH, complexvorming, temperatuur,
oxidatiegraad, …
• Sensitiviteit: De sensitiviteit of gevoeligheid van een
methode wordt bepaald door de helling van de ijklijn,
oftewel de verhouding van het gemeten signaal op de
concentratie:
𝑔𝑒𝑚𝑒𝑡𝑒𝑛 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑎𝑙
ℎ𝑜𝑔𝑒 ℎ𝑒𝑙𝑙𝑖𝑛𝑔 = ↑ = ℎ𝑜𝑔𝑒 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑒
𝑔𝑒𝑚𝑒𝑡𝑒𝑛 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑎𝑙
𝑘𝑙𝑒𝑖𝑛𝑒 ℎ𝑒𝑙𝑙𝑖𝑛𝑔 = ↓ = 𝑙𝑎𝑔𝑒 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑒
De karakteristieke concentratie is ook een maat voor de
sensitiviteit, dit is de hoeveelheid (in 𝜇𝑔) van de te
bepalen stof die een absorbantie van 0,0044 (= 1%
absorptie) teweegbrengt)
3
Biochemie II
Door Zeno De Paus
,Zeno De Paus Analytische biochemie II 2de Bach. BMW
Inhoud
Hoofdstuk 1: Analytische performantie, kwaliteitscontrole en kalibratie ..................................................................3
Analytische performantie ................................................................................................................................................................3
Kwaliteitscontrole ...............................................................................................................................................................................5
Kalibratie van de biochemische analyse....................................................................................................................................5
Externe kalibratie...........................................................................................................................................................................6
Interne kalibratie ...........................................................................................................................................................................7
Verschillende fasen en fouten van de biochemische analyse ...........................................................................................8
Hoofdstuk 2: Radio-isotopen ......................................................................................................................................................9
Radioactiviteit: inleiding ..................................................................................................................................................................9
Detectie en meting van radioactiviteit .................................................................................................................................... 12
Hoofdstuk 3: Elektrochemie en biosensoren ..................................................................................................................... 14
Elektrochemie .................................................................................................................................................................................... 14
Inleiding .......................................................................................................................................................................................... 14
Het potentiaal tussen metalen en oplossingen .............................................................................................................. 16
Elektrochemische cellen .......................................................................................................................................................... 17
Analytische methoden .............................................................................................................................................................. 18
Biosensoren ........................................................................................................................................................................................ 20
1
,Zeno De Paus Analytische biochemie II 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 4: Spectrometrische analysemethoden........................................................................................................... 21
Inleiding ................................................................................................................................................................................................ 21
Het elektromagnetisch spectrum (EM-spectrum) ....................................................................................................... 22
Molecuul- en atoomspectra .................................................................................................................................................... 23
Moleculair: UV-VIS............................................................................................................................................................................ 24
Algemeen principe ...................................................................................................................................................................... 24
Onderdelen van de spectrofotometer ................................................................................................................................ 25
Controle van de werking van een spectrofotometer ................................................................................................... 26
Moleculair: IR (InfraRood) ........................................................................................................................................................... 27
Fysische principes ....................................................................................................................................................................... 27
Het IR-spectrogram .................................................................................................................................................................... 28
Moleculair: Fluorimetrie ............................................................................................................................................................... 29
Fysische principes ....................................................................................................................................................................... 29
Opbouw ........................................................................................................................................................................................... 30
Intensiteit van de fluorescentie ............................................................................................................................................ 31
Suspensie: turbidimetrie, nefelometrie en refractometrie ............................................................................................ 32
Moleculair: NMR-spectrometrie ................................................................................................................................................ 33
Inleiding .......................................................................................................................................................................................... 33
Het 1H NMR spectrum .............................................................................................................................................................. 34
Het 13C NMR spectrum ............................................................................................................................................................ 36
Atoomspectrofotometrie ............................................................................................................................................................... 38
Atomair: FAAS en ETAAS .......................................................................................................................................................... 38
Atomair: Vlamfotometrie ......................................................................................................................................................... 39
Atomair: Inductief gekoppelde plasma emissie spectrometrie (ICPES) ............................................................ 40
Massaspectrometrie ........................................................................................................................................................................ 41
Inleiding .......................................................................................................................................................................................... 41
Ionisatie ........................................................................................................................................................................................... 41
Massa analyse ............................................................................................................................................................................... 42
Detector en tandem .................................................................................................................................................................... 43
Peptidefragmentatie en spectra............................................................................................................................................ 44
Hoofdstuk 5: Analyse van biomoleculen in praktijk ........................................................................................................ 46
Morfologische analyse .................................................................................................................................................................... 46
Biochemische / enzymatische analyse ................................................................................................................................... 47
2
, Zeno De Paus Analytische biochemie II 2de Bach. BMW
Hoofdstuk 1: Analytische performantie,
kwaliteitscontrole en kalibratie
Analytische performantie
Bespreek het verschil tussen een kwalitatieve en een kwantitatieve analyse. Hoe meten we deze?
Voor biochemisch onderzoek kun je zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses uitvoeren:
• Kwalitatieve analyse → We onderzoeken of een bepaald moleculen aanwezig is in een
bepaald staal
• Kwantitatieve analyse → We onderzoeken de relatieve hoeveelheid moleculen die
aanwezig zijn in een bepaal staal
o Partiële analyse: Je analyseert de relatieve hoeveelheid van enkele moleculen in
het staal
o Totaalanalyse: Je analyseert de relatieve hoeveelheid van alle moleculen in het
staal
o Individuele analyse: Je onderzoekt één component, bijvoorbeeld het
glucosegehalte in het bloed
o Groepsanalyse: Je onderzoekt een aantal verwante componenten, bijvoorbeeld
het suikergehalte in het bloed
Deze soorten analyses berusten op metingen van een fysische of fysicochemische grootheid die
recht of omgekeerd evenredig is met de hoeveelheid staal aanwezig. Voorbeelden zijn
stroomsterkte, massa, radioactiviteit, lichtabsorptie, fluorescentie, enzovoort
Bespreek de parameters ‘specificiteit’, ‘selectiviteit’, en‘ sensitiviteit’, met betrekking tot
biochemisch onderzoek
Voor biochemisch onderzoek moet men altijd nagaan of de specificiteit en selectiviteit in orde is:
• Specificiteit: Een reactie is specifiek als het enkel het gewenste bestanddeel detecteert
• Selectiviteit: Een test is selectief wanneer hij het gewenste bestanddeel detecteerd, maar
eventueel ook andere bestanddelen kan detecteren. De selectiviteit kan worden
aangepast door enkele parameters zoals de pH, complexvorming, temperatuur,
oxidatiegraad, …
• Sensitiviteit: De sensitiviteit of gevoeligheid van een
methode wordt bepaald door de helling van de ijklijn,
oftewel de verhouding van het gemeten signaal op de
concentratie:
𝑔𝑒𝑚𝑒𝑡𝑒𝑛 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑎𝑙
ℎ𝑜𝑔𝑒 ℎ𝑒𝑙𝑙𝑖𝑛𝑔 = ↑ = ℎ𝑜𝑔𝑒 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑒
𝑔𝑒𝑚𝑒𝑡𝑒𝑛 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑎𝑙
𝑘𝑙𝑒𝑖𝑛𝑒 ℎ𝑒𝑙𝑙𝑖𝑛𝑔 = ↓ = 𝑙𝑎𝑔𝑒 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑒
De karakteristieke concentratie is ook een maat voor de
sensitiviteit, dit is de hoeveelheid (in 𝜇𝑔) van de te
bepalen stof die een absorbantie van 0,0044 (= 1%
absorptie) teweegbrengt)
3
