Hoofdstuk 1: Inleiding
Biochemie bestudeert de chemische processen in levende systemen.
Dezelfde chemische wetten (evenwicht, reactiesnelheid, vrije energie, enz.)
gelden in cellen als in een laboratorium
Cellen zijn uiterst complex. Een menselijke cel bevat miljoenen verschillende
eiwitten en andere moleculen die in een zeer klein volume met elkaar
interageren.
Ruimtelijke organisatie is cruciaal. Organellen en membraandomeinen
zorgen ervoor dat moleculen elkaar wel of niet kunnen ontmoeten, waardoor
reacties gereguleerd worden.
Experimentele beperkingen. Veel biochemische experimenten gebeuren met
cellysaten of vereenvoudigde systemen, waardoor de natuurlijke celstructuur
verloren gaat en resultaten soms minder representatief zijn voor levende cellen.
Doel van de biochemie?
Begrijpen welke moleculen, interacties en reacties biologische processen
veroorzaken en hoe deze kwantitatief gereguleerd worden (concentraties,
snelheids- en evenwichtsconstanten).
Doel van het vak analytische biochemie. Niet de biochemische processen zelf,
maar de methoden leren waarmee je:
- moleculen kunt identificeren;
- concentraties kunt bepalen;
- interacties kunt bestuderen;
- omzettingen van moleculen kunt volgen.
Nadruk op inzicht, niet op memoriseren. Je moet kunnen uitleggen:
- hoe een methode werkt;
- hoe de opstelling eruitziet;
- waarvoor de methode wel en niet geschikt is;
- waarom elk onderdeel nodig is;
- hoe verschillende methoden gecombineerd kunnen worden.
Biologische systemen bestaan uit te veel variabelen om in 1 keer te begrijpen ->
verdeel vraagstelling in subproblemen die wel hanteerbaar zijn
2 strategieën:
1. behoud structuur van biologisch systeem en gebruik methodes die slechts
gevoelig zijn voor één of enkele componenten in het cellulair systeem
a. top down aanpak
b. microscopie en labelling
2. zuiver de componenten waarin men geïnteresseerd is op uit het systeem
en bestudeer de eigenschappen en interactief afzonderlijk
1
, a. bottom up aanpak
b. zeer veel verschillende methodes/technieken
c. tegenwoordig ook dikwijls recombinatie expressie van componenten
ipv opzuivering
deze cursus
Preparatief => materiaal opzuiveren om mee verder te werken (niet-destructief)
Analytisch => meestal destructief
Elke methodes: zowel destructief als niet-destructieve aanpakken
destructief is altijd analytisch. Niet-destructief kan zowel preparatief als
analytisch zijn
Buffers
Waarom zijn buffers belangrijk?
- Biomoleculen functioneren alleen goed in een waterige omgeving.
- De pH, ionsterkte en samenstelling van die omgeving bepalen hoe
biomoleculen zich gedragen.
- Daarom worden in de biochemie altijd buffers gebruikt om de pH
constant te houden.
Wat is een buffer?
- Een buffer is een oplossing met een zwak zuur (HA) en de
geconjugeerde base (A⁻) (of omgekeerd).
- Het zuur-base-evenwicht is:
+ ¿¿
−¿+H ¿
HA ⇌ A
Henderson-Hasselbalchvergelijking
Deze beschrijft de relatie tussen pH, pKa en de verhouding zuur/base:
pH=p K a + log ¿ ¿
Praktisch:
- pH = pKa → evenveel zuur als base.
- Meer A⁻ → hogere pH.
- Meer HA → lagere pH.
Na het bereiden wordt de pH in het labo meestal nog fijn afgesteld met HCl of
NaOH en gecontroleerd met een pH-elektrode.
Buffercapaciteit (β)
2
,Definitie:
De buffercapaciteit geeft aan hoe goed een buffer een verandering in pH
kan weerstaan.
d Cb
β=
d ( pH )
→ Hoe groter β, hoe meer zuur of base moet worden toegevoegd om de pH met 1
eenheid te veranderen.
Waar hangt de buffercapaciteit van af?
1. Afstand tussen pH en pKa
o Grootst wanneer pH ≈ pKa.
o Daarom gebruik je een buffer idealiter bij pKa ± 1, maar liefst nog
dichter bij de pKa.
2. Bufferconcentratie
o Hoe hoger de totale concentratie (cT = cA + cB), hoe groter de
buffercapaciteit.
Veelgebruikte buffers
Een goede buffer:
- is niet toxisch;
- reageert zo weinig mogelijk met andere moleculen.
Ionische sterkte
De ionische sterkte is een maat voor de hoeveelheid en lading van ionen in een
buffer:
1
I=
2
∑ c i z2i
Een hogere ionische sterkte schermt elektrische ladingen sterker af, waardoor
geladen biomoleculen elkaar minder beïnvloeden.
Door deze afscherming is de activiteit van een ion lager dan zijn werkelijke
concentratie:
a=γc
De activiteitscoëfficiënt γ hangt af van de ionische sterkte. Daardoor kan ook de
effectieve pKa van een buffer veranderen.
Voor eiwitten geldt:
- Bij lage ionische sterkte kunnen ladingsinteracties aggregatie veroorzaken.
- Bij matige ionische sterkte stijgt de oplosbaarheid: inzouten.
- Bij hoge ionische sterkte daalt de oplosbaarheid opnieuw: uitzouten.
3
, - De oplosbaarheid is meestal minimaal bij het iso-elektrisch punt pI ,
waar het eiwit geen nettolading heeft.
Buffers kunnen extra stoffen bevatten, zoals protease-inhibitoren, reducerende
stoffen, EDTA/EGTA of detergenten, afhankelijk van de toepassing.
Vereisten voor een opzuivering
Opzuivering is het scheiden van opgeloste stoffen volgens molecuultype.
Meestal wil men de gewenste componenten in een geschikte buffer verkrijgen en
ze voldoende intact houden.
Er zijn twee soorten:
Preparatieve opzuivering: grotere hoeveelheden voor opslag of later
gebruik. Structuur en biologische activiteit moeten zo goed mogelijk
behouden blijven.
Analytische opzuivering: kleinere hoeveelheden voor een onmiddellijke
meting. Volledige structuur of functionaliteit hoeft niet altijd behouden te
blijven.
Hoe zuiver een staal moet zijn, hangt af van de verdere toepassing. Een weinig
specifieke meetmethode vereist een sterk gezuiverd staal, terwijl een selectieve
methode zoals ELISA vaak met weinig of geen voorafgaande opzuivering kan
werken.
Overzicht van een opzuivering
Een opzuivering bestaat doorgaans uit de volgende stappen:
ruw staal → extractie → scheiding → kwaliteitscontrole → opslag of
gebruik
De scheidingsstap kan meerdere keren worden herhaald. Welke methoden men
kiest, hangt af van het soort staal, de eigenschappen van de gewenste
moleculen, de vereiste zuiverheid en de vraag of de moleculen na afloop nog
intact en functioneel moeten zijn.
1. EXTRACTIE
Bij extractie worden de gewenste componenten vrijgemaakt uit het ruwe
materiaal, bijvoorbeeld uit cellen, weefsel of organismen. Extractie bestaat
meestal uit homogenisatie, cellysis en het verwijderen van grote
celfragmenten.
Er wordt een onderscheid gemaakt tussen:
- Zachte extractie: structuur, eiwitvouwing en biologische activiteit blijven
zoveel mogelijk behouden.
4
Biochemie bestudeert de chemische processen in levende systemen.
Dezelfde chemische wetten (evenwicht, reactiesnelheid, vrije energie, enz.)
gelden in cellen als in een laboratorium
Cellen zijn uiterst complex. Een menselijke cel bevat miljoenen verschillende
eiwitten en andere moleculen die in een zeer klein volume met elkaar
interageren.
Ruimtelijke organisatie is cruciaal. Organellen en membraandomeinen
zorgen ervoor dat moleculen elkaar wel of niet kunnen ontmoeten, waardoor
reacties gereguleerd worden.
Experimentele beperkingen. Veel biochemische experimenten gebeuren met
cellysaten of vereenvoudigde systemen, waardoor de natuurlijke celstructuur
verloren gaat en resultaten soms minder representatief zijn voor levende cellen.
Doel van de biochemie?
Begrijpen welke moleculen, interacties en reacties biologische processen
veroorzaken en hoe deze kwantitatief gereguleerd worden (concentraties,
snelheids- en evenwichtsconstanten).
Doel van het vak analytische biochemie. Niet de biochemische processen zelf,
maar de methoden leren waarmee je:
- moleculen kunt identificeren;
- concentraties kunt bepalen;
- interacties kunt bestuderen;
- omzettingen van moleculen kunt volgen.
Nadruk op inzicht, niet op memoriseren. Je moet kunnen uitleggen:
- hoe een methode werkt;
- hoe de opstelling eruitziet;
- waarvoor de methode wel en niet geschikt is;
- waarom elk onderdeel nodig is;
- hoe verschillende methoden gecombineerd kunnen worden.
Biologische systemen bestaan uit te veel variabelen om in 1 keer te begrijpen ->
verdeel vraagstelling in subproblemen die wel hanteerbaar zijn
2 strategieën:
1. behoud structuur van biologisch systeem en gebruik methodes die slechts
gevoelig zijn voor één of enkele componenten in het cellulair systeem
a. top down aanpak
b. microscopie en labelling
2. zuiver de componenten waarin men geïnteresseerd is op uit het systeem
en bestudeer de eigenschappen en interactief afzonderlijk
1
, a. bottom up aanpak
b. zeer veel verschillende methodes/technieken
c. tegenwoordig ook dikwijls recombinatie expressie van componenten
ipv opzuivering
deze cursus
Preparatief => materiaal opzuiveren om mee verder te werken (niet-destructief)
Analytisch => meestal destructief
Elke methodes: zowel destructief als niet-destructieve aanpakken
destructief is altijd analytisch. Niet-destructief kan zowel preparatief als
analytisch zijn
Buffers
Waarom zijn buffers belangrijk?
- Biomoleculen functioneren alleen goed in een waterige omgeving.
- De pH, ionsterkte en samenstelling van die omgeving bepalen hoe
biomoleculen zich gedragen.
- Daarom worden in de biochemie altijd buffers gebruikt om de pH
constant te houden.
Wat is een buffer?
- Een buffer is een oplossing met een zwak zuur (HA) en de
geconjugeerde base (A⁻) (of omgekeerd).
- Het zuur-base-evenwicht is:
+ ¿¿
−¿+H ¿
HA ⇌ A
Henderson-Hasselbalchvergelijking
Deze beschrijft de relatie tussen pH, pKa en de verhouding zuur/base:
pH=p K a + log ¿ ¿
Praktisch:
- pH = pKa → evenveel zuur als base.
- Meer A⁻ → hogere pH.
- Meer HA → lagere pH.
Na het bereiden wordt de pH in het labo meestal nog fijn afgesteld met HCl of
NaOH en gecontroleerd met een pH-elektrode.
Buffercapaciteit (β)
2
,Definitie:
De buffercapaciteit geeft aan hoe goed een buffer een verandering in pH
kan weerstaan.
d Cb
β=
d ( pH )
→ Hoe groter β, hoe meer zuur of base moet worden toegevoegd om de pH met 1
eenheid te veranderen.
Waar hangt de buffercapaciteit van af?
1. Afstand tussen pH en pKa
o Grootst wanneer pH ≈ pKa.
o Daarom gebruik je een buffer idealiter bij pKa ± 1, maar liefst nog
dichter bij de pKa.
2. Bufferconcentratie
o Hoe hoger de totale concentratie (cT = cA + cB), hoe groter de
buffercapaciteit.
Veelgebruikte buffers
Een goede buffer:
- is niet toxisch;
- reageert zo weinig mogelijk met andere moleculen.
Ionische sterkte
De ionische sterkte is een maat voor de hoeveelheid en lading van ionen in een
buffer:
1
I=
2
∑ c i z2i
Een hogere ionische sterkte schermt elektrische ladingen sterker af, waardoor
geladen biomoleculen elkaar minder beïnvloeden.
Door deze afscherming is de activiteit van een ion lager dan zijn werkelijke
concentratie:
a=γc
De activiteitscoëfficiënt γ hangt af van de ionische sterkte. Daardoor kan ook de
effectieve pKa van een buffer veranderen.
Voor eiwitten geldt:
- Bij lage ionische sterkte kunnen ladingsinteracties aggregatie veroorzaken.
- Bij matige ionische sterkte stijgt de oplosbaarheid: inzouten.
- Bij hoge ionische sterkte daalt de oplosbaarheid opnieuw: uitzouten.
3
, - De oplosbaarheid is meestal minimaal bij het iso-elektrisch punt pI ,
waar het eiwit geen nettolading heeft.
Buffers kunnen extra stoffen bevatten, zoals protease-inhibitoren, reducerende
stoffen, EDTA/EGTA of detergenten, afhankelijk van de toepassing.
Vereisten voor een opzuivering
Opzuivering is het scheiden van opgeloste stoffen volgens molecuultype.
Meestal wil men de gewenste componenten in een geschikte buffer verkrijgen en
ze voldoende intact houden.
Er zijn twee soorten:
Preparatieve opzuivering: grotere hoeveelheden voor opslag of later
gebruik. Structuur en biologische activiteit moeten zo goed mogelijk
behouden blijven.
Analytische opzuivering: kleinere hoeveelheden voor een onmiddellijke
meting. Volledige structuur of functionaliteit hoeft niet altijd behouden te
blijven.
Hoe zuiver een staal moet zijn, hangt af van de verdere toepassing. Een weinig
specifieke meetmethode vereist een sterk gezuiverd staal, terwijl een selectieve
methode zoals ELISA vaak met weinig of geen voorafgaande opzuivering kan
werken.
Overzicht van een opzuivering
Een opzuivering bestaat doorgaans uit de volgende stappen:
ruw staal → extractie → scheiding → kwaliteitscontrole → opslag of
gebruik
De scheidingsstap kan meerdere keren worden herhaald. Welke methoden men
kiest, hangt af van het soort staal, de eigenschappen van de gewenste
moleculen, de vereiste zuiverheid en de vraag of de moleculen na afloop nog
intact en functioneel moeten zijn.
1. EXTRACTIE
Bij extractie worden de gewenste componenten vrijgemaakt uit het ruwe
materiaal, bijvoorbeeld uit cellen, weefsel of organismen. Extractie bestaat
meestal uit homogenisatie, cellysis en het verwijderen van grote
celfragmenten.
Er wordt een onderscheid gemaakt tussen:
- Zachte extractie: structuur, eiwitvouwing en biologische activiteit blijven
zoveel mogelijk behouden.
4
