Moleculaire biologie
Hoofdstuk 1: Inleiding
1. Inleiding
Wat is leven?
Levende organismen zijn afgescheiden van hun omgeving. Er is veel
verschil in samenstelling van de elementen.
Ze bestaan uit biomoleculen: eiwitten, vetten, koolhydraten,
nucleïnezuren.
Het beweegt.
Energie opnemen uit de omgeving.
Kenmerken erfelijk doorgeven.
Groeien.
Communiceren met elkaar en interpreteren prikkels.
De kleinste eenheid van levende organismen: de cel
Wij zijn eukaryoten maar zitten vol met prokaryoten ze vormen onze
microbioom en zijn noodzakelijk.
De basis van de moleculaire biologie is het centrale dogma: DNA wordt
gerepliceerd en overgeschreven naar RNA, die wordt omgezet naar
eiwitten.
Erfelijkheidsleer van Mendel:
Er waren van bloemen een witte en een rode soort, als je die kruist krijg je
roze bloemen. En als je die nakomelingen gaat kweken krijg je terug rood
en wit en roos. Zo zag hij dus dat kenmerken erfbaar zijn en
overeenkomen met genen. Elk kenmerk wordt 2 keer gecodeerd en slechts
1 ervan wordt doorgegeven. Deze kunnen dominant of recessief zijn.
Garrod:
Hij legde het verband tussen biochemische aandoeningen en de regels van
Mendel. Hij bestudeerde families met alkaptonurie (urine die zwart kleurt).
Hij zag dat deze ziekte zich als een recessieve eigenschap verspreidde.
Zwarte urine is niet zo erg maar er is een ophoping van
homogentisinezuur die zwart kleurt in het kraakbeen die stof breekt
tyrosine af want een teveel eraan is gevaarlijk.
Nu wou men nog weten op welk biomolecule die erfelijke eigenschappen
zaten. Ze zagen op de beelden al dat er allemaal zwarte worstjes waren
7
,maar wisten nogsteeds niet wat dit waren dus gingen ze de biomoleculen
scheiden.
Van een weefsel maken we een homogenaat door cellen van elkaar de
breken.
Door sonicatie. Door de trillingen van een stemvork gaan alle cellen
openbarsten.
Mechanisch met een mixer of alles door een klein gaatje persen.
Met detergenten= de celwand oplossen zodat cellen openbreken.
Dan gaan ze centrifugeren om de componenten te scheiden. Alle
componenten gaan migreren naar de tip van de proefbuis door
middelpuntvliedende kracht. Het onderste (zwaarste
componenten) is een pellet en de vloeistof is het
supernatans.
Types centrifugatie:
Differentiële centrifugatie
op verschillende snelheden
Eerst traag zodat we een pellet krijgen van de
nuclei die we er dan uithalen. Dan een iets
snellere snelheid waardoor we een pellet krijgen van
mitochondriën… dat halen we er dan weer uit en het
overige supernatans weer sneller centrifugeren. Dit
herhalen we steeds en dan houden we cytosol over.
Densiteitscentrifugatie
We maken een buffer en voegen sucrose toe, dan nog
een met een beetje minder sucrose, nog eentje met nog
minder,… zodat je een gradatie krijgt van densiteiten. Bij
centrifugatie gaan de componenten migreren richting de tip van de
proefbuis en stoppen als ze een laag tegenkomen met een grotere
massadichtheid (opwaartse kracht is zo dus hoger).
We gaan het homogenaat mengen met CsCl en centrifugeren met
hoge snelheid. Hierdoor ontstaat een gradiënt van CsCl met een
hoge concentratie vanonder en een lage bovenaan, de componenten
blijven dus weer zitten in de laag waar de opwaartse kracht groter is.
Deze manier is heel gevoelig, het kan zelfs verschillen in isotopen
detecteren.
Experiment van Griffith:
8
,Toont aan dat DNA de drager is van de kenmerken. Hij onderzocht
streptococcus pneumoniae in muizen, die gingen eraan dood. Hij kweekte
de sp op voedingsbodems, zo had hij geen muizen meer nodig. Na lang
kweken van de oorspronkelijke S-stam ontstond er blijkbaar een nieuwe
soort nl. de R-stam. De S was dodelijk (virulent), de R niet. Hij maakte een
extract van de S-stam en haalde het DNA eruit en injecteerde alle aparte
componenten (biomoleculen: RNA, eiwitten, …) ervan in de muis
resultaat: ze leefden allemaal.
Ander experiment: muizen met R-stam en een component van de S-stam
injecteren alle overleven behalve degenen met combinatie van R-stam
en S-DNA stierven de R-stam heeft het slechte S-DNA opgenomen en tot
expressie gebracht.
Conclusie:
- De virulente eigenschap zit in het DNA van de S-stam.
- Bacteriën kunnen DNA vanuit de omgeving opnemen en in hun eigen
DNA inbouwen= transformatie.
Experiment van Hershey Chase:
Ze gebruikten de E-coli bacterie en daarvan bestaan er bacteriofagen die
die gaan aanvallen. Die bacteriofagen bestaan enkel uit DNA en eiwitten,
zo kan je dus makkelijker onderzoeken waar de virulente eigenschap zit.
Als je E-colis neemt en er bacteriofagen bij doet gaat de bacteriofaag die
E-colis herprogrammeren zodat ze bacteriofaag-eiwitten en –DNA gaan
maken. De kenmerken van die E-coli veranderen dus helemaal.
Ze deden voor 5 minuten E-colis en bacteriofagen bij elkaar en gingen dan
schudden zodat die bacteriofagen terug loskomen van de bacteriën. Als je
dan gaat centrifugeren krijg je in de tip de E-coli (zwaarst). Als je die E-
colis eruit gaat halen en ze in een cultuurmedium brengt ga je zien dat die
zelf bacteriofagen gingen maken (dus 5 min. is genoeg om die E-colis te
besmetten).
In een eerste cultuur gingen ze E-colis en bacteriofagen samenmengen
met S35, waardoor die eiwitten van de bacteriofagen
radioactief werden.
In een tweede cultuur hebben ze er P32 bijgedaan,
waardoor het DNA van de bacteriofagen radioactief
werd.
Experiment:
a) E-coli + eiwit radioactieve bacteriofagen 5
min. laten zitten, schudden en centrifugeren
resultaat pellet bestond uit E-colis, de radioactieve eiwitten van de
9
, bacteriofagen zaten in het supernatans (dus E-coli had geen eiwit
gekregen van de bacteriofagen)
b) E-coli + DNA radioactieve bacteriofagen 5 min. laten zitten,
schudden en centrifugeren radioactiviteit zat wel in de pellet (dus
ze ontdekten dat de info om bacteriofagen te maken in het DNA zit).
2. Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Het is een polymeer.
Acid komt van dat er fosfaat in zit.
Per fosfaat zit er een deoxyribose (=specifieke suiker ribose
(cyclische structuur) waarbij op de 2’C een deoxy is gebeurt).
Nucleobasen: vallen uit elkaar in:
Pyrimidines (cyclische structuur met N op de 1e en
3e plek)
maken met positie 1 verbinding met het ribose
o cytosine op positie 4 een NH2
o thymine heeft op positie 2, 4 een O en op 5
een methylgroep
Purines (dicyclisch)
maken met positie 9 verbinding met het ribose
o adenine heeft op positie 6 een NH2
o guanine heeft op positie 6 een O, 2 een NH2
Binding tussen fosfaat, deoxyribose en een nucleobase: op de 5’C
komt de fosfaatgroep, op de 1’C komt het nucleobase (=N-
glycosidische binding).
Fosfodiesterbinding binding tussen fosfaat en C aan 2 kanten
Nucleoside= nucleobase + ribose als er een fosfaat op de 5’C
komt is het een nucleotide
Biomolecules die nucleobasen, ribose of verwante moleculen
bevatten:
10
Hoofdstuk 1: Inleiding
1. Inleiding
Wat is leven?
Levende organismen zijn afgescheiden van hun omgeving. Er is veel
verschil in samenstelling van de elementen.
Ze bestaan uit biomoleculen: eiwitten, vetten, koolhydraten,
nucleïnezuren.
Het beweegt.
Energie opnemen uit de omgeving.
Kenmerken erfelijk doorgeven.
Groeien.
Communiceren met elkaar en interpreteren prikkels.
De kleinste eenheid van levende organismen: de cel
Wij zijn eukaryoten maar zitten vol met prokaryoten ze vormen onze
microbioom en zijn noodzakelijk.
De basis van de moleculaire biologie is het centrale dogma: DNA wordt
gerepliceerd en overgeschreven naar RNA, die wordt omgezet naar
eiwitten.
Erfelijkheidsleer van Mendel:
Er waren van bloemen een witte en een rode soort, als je die kruist krijg je
roze bloemen. En als je die nakomelingen gaat kweken krijg je terug rood
en wit en roos. Zo zag hij dus dat kenmerken erfbaar zijn en
overeenkomen met genen. Elk kenmerk wordt 2 keer gecodeerd en slechts
1 ervan wordt doorgegeven. Deze kunnen dominant of recessief zijn.
Garrod:
Hij legde het verband tussen biochemische aandoeningen en de regels van
Mendel. Hij bestudeerde families met alkaptonurie (urine die zwart kleurt).
Hij zag dat deze ziekte zich als een recessieve eigenschap verspreidde.
Zwarte urine is niet zo erg maar er is een ophoping van
homogentisinezuur die zwart kleurt in het kraakbeen die stof breekt
tyrosine af want een teveel eraan is gevaarlijk.
Nu wou men nog weten op welk biomolecule die erfelijke eigenschappen
zaten. Ze zagen op de beelden al dat er allemaal zwarte worstjes waren
7
,maar wisten nogsteeds niet wat dit waren dus gingen ze de biomoleculen
scheiden.
Van een weefsel maken we een homogenaat door cellen van elkaar de
breken.
Door sonicatie. Door de trillingen van een stemvork gaan alle cellen
openbarsten.
Mechanisch met een mixer of alles door een klein gaatje persen.
Met detergenten= de celwand oplossen zodat cellen openbreken.
Dan gaan ze centrifugeren om de componenten te scheiden. Alle
componenten gaan migreren naar de tip van de proefbuis door
middelpuntvliedende kracht. Het onderste (zwaarste
componenten) is een pellet en de vloeistof is het
supernatans.
Types centrifugatie:
Differentiële centrifugatie
op verschillende snelheden
Eerst traag zodat we een pellet krijgen van de
nuclei die we er dan uithalen. Dan een iets
snellere snelheid waardoor we een pellet krijgen van
mitochondriën… dat halen we er dan weer uit en het
overige supernatans weer sneller centrifugeren. Dit
herhalen we steeds en dan houden we cytosol over.
Densiteitscentrifugatie
We maken een buffer en voegen sucrose toe, dan nog
een met een beetje minder sucrose, nog eentje met nog
minder,… zodat je een gradatie krijgt van densiteiten. Bij
centrifugatie gaan de componenten migreren richting de tip van de
proefbuis en stoppen als ze een laag tegenkomen met een grotere
massadichtheid (opwaartse kracht is zo dus hoger).
We gaan het homogenaat mengen met CsCl en centrifugeren met
hoge snelheid. Hierdoor ontstaat een gradiënt van CsCl met een
hoge concentratie vanonder en een lage bovenaan, de componenten
blijven dus weer zitten in de laag waar de opwaartse kracht groter is.
Deze manier is heel gevoelig, het kan zelfs verschillen in isotopen
detecteren.
Experiment van Griffith:
8
,Toont aan dat DNA de drager is van de kenmerken. Hij onderzocht
streptococcus pneumoniae in muizen, die gingen eraan dood. Hij kweekte
de sp op voedingsbodems, zo had hij geen muizen meer nodig. Na lang
kweken van de oorspronkelijke S-stam ontstond er blijkbaar een nieuwe
soort nl. de R-stam. De S was dodelijk (virulent), de R niet. Hij maakte een
extract van de S-stam en haalde het DNA eruit en injecteerde alle aparte
componenten (biomoleculen: RNA, eiwitten, …) ervan in de muis
resultaat: ze leefden allemaal.
Ander experiment: muizen met R-stam en een component van de S-stam
injecteren alle overleven behalve degenen met combinatie van R-stam
en S-DNA stierven de R-stam heeft het slechte S-DNA opgenomen en tot
expressie gebracht.
Conclusie:
- De virulente eigenschap zit in het DNA van de S-stam.
- Bacteriën kunnen DNA vanuit de omgeving opnemen en in hun eigen
DNA inbouwen= transformatie.
Experiment van Hershey Chase:
Ze gebruikten de E-coli bacterie en daarvan bestaan er bacteriofagen die
die gaan aanvallen. Die bacteriofagen bestaan enkel uit DNA en eiwitten,
zo kan je dus makkelijker onderzoeken waar de virulente eigenschap zit.
Als je E-colis neemt en er bacteriofagen bij doet gaat de bacteriofaag die
E-colis herprogrammeren zodat ze bacteriofaag-eiwitten en –DNA gaan
maken. De kenmerken van die E-coli veranderen dus helemaal.
Ze deden voor 5 minuten E-colis en bacteriofagen bij elkaar en gingen dan
schudden zodat die bacteriofagen terug loskomen van de bacteriën. Als je
dan gaat centrifugeren krijg je in de tip de E-coli (zwaarst). Als je die E-
colis eruit gaat halen en ze in een cultuurmedium brengt ga je zien dat die
zelf bacteriofagen gingen maken (dus 5 min. is genoeg om die E-colis te
besmetten).
In een eerste cultuur gingen ze E-colis en bacteriofagen samenmengen
met S35, waardoor die eiwitten van de bacteriofagen
radioactief werden.
In een tweede cultuur hebben ze er P32 bijgedaan,
waardoor het DNA van de bacteriofagen radioactief
werd.
Experiment:
a) E-coli + eiwit radioactieve bacteriofagen 5
min. laten zitten, schudden en centrifugeren
resultaat pellet bestond uit E-colis, de radioactieve eiwitten van de
9
, bacteriofagen zaten in het supernatans (dus E-coli had geen eiwit
gekregen van de bacteriofagen)
b) E-coli + DNA radioactieve bacteriofagen 5 min. laten zitten,
schudden en centrifugeren radioactiviteit zat wel in de pellet (dus
ze ontdekten dat de info om bacteriofagen te maken in het DNA zit).
2. Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Het is een polymeer.
Acid komt van dat er fosfaat in zit.
Per fosfaat zit er een deoxyribose (=specifieke suiker ribose
(cyclische structuur) waarbij op de 2’C een deoxy is gebeurt).
Nucleobasen: vallen uit elkaar in:
Pyrimidines (cyclische structuur met N op de 1e en
3e plek)
maken met positie 1 verbinding met het ribose
o cytosine op positie 4 een NH2
o thymine heeft op positie 2, 4 een O en op 5
een methylgroep
Purines (dicyclisch)
maken met positie 9 verbinding met het ribose
o adenine heeft op positie 6 een NH2
o guanine heeft op positie 6 een O, 2 een NH2
Binding tussen fosfaat, deoxyribose en een nucleobase: op de 5’C
komt de fosfaatgroep, op de 1’C komt het nucleobase (=N-
glycosidische binding).
Fosfodiesterbinding binding tussen fosfaat en C aan 2 kanten
Nucleoside= nucleobase + ribose als er een fosfaat op de 5’C
komt is het een nucleotide
Biomolecules die nucleobasen, ribose of verwante moleculen
bevatten:
10
