1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Wat kan je met beide technieken
onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
A. Wat kan je onderzoeken? Verschil in werking?
Lichtmicroscopie Elektronenmicroscopie
Resolutie: ~0,2 µm Resolutie: < 0,1 nm (veel hoger)
Laat toe om: Laat toe om:
- Algemene weefselstructuur te bekijken - Ultrastructuur van cellen te bestuderen
- Cellen en celkernen te onderscheiden - Organellen en membranen te zien
- Verschillen tussen normaal en tumorweefsel te zien - Lokalisatie van eiwitten (met goud-gelabelde
(bv. meer kernen) antilichamen)
Typisch gebruik: Typisch gebruik:
- Histologie (H&E kleuring) - Detailstudie van celstructuren
- Diagnose van tumoren op weefselniveau - Membranen en intracellulaire componenten
Werkt met zichtbaar licht. Licht gaat door het weefsel en wordt Werkt met elektronen. Elektronen gaan door het weefsel. De
via lenzen vergroot. detectie is afhankelijk van de dikte van het weefsel en de
aanwezigheid van zware atomen (bv. osmium).
Dun weefsel → veel e- → licht
Dik/zwaar weefsel → weinig e- → donker
, B. Voorbewerking van weefsel
Invriezen (snap/flash-freezen) met vloeibare stikstof en dan kleuren
Het einddoel hierbij is het maken van schijfjes uit tumorstaal, zodat je door 1 schijfje kan kijken met de microscoop. Hierbij moet het schijfje
voor lichtmicroscopie 3-10 μm dun zijn, en voor e-microscopie moet het schijfje <0,1 μm dun zijn.
OF
Staal fixeren (= vastzetten) met fixatief (= sterk water) en dan kleuren
- bij dit proces gaat bv formol ervoor zorgen dat de biologische en metabole processen worden stilgelegd
- eiwitten bestaan uit N – R – COOH (amino- en carboxy-groep)
- bij fixatieproces zullen er covalente bindingen gevormd worden met het eiwit
- door die bindingen te maken worden ze als het ware vastgezet
- dit proces kan een tijdje duren
- formol is ideaal voor lichtmicroscopie, hierdoor worden eiwitten die dicht bij elkaar liggen verbonden
- bij e-microscopie gebruik je beter glutaaraldehyde, deze heeft 4C, itt tot formol die maar 1C heeft → hierdoor kunnen eiwitten die
verder van elkaar liggen ook verbonden worden, de afstand tussen de moleculen die je kan verbinden is dus langer en hierdoor heb
je een stevige fixatie
- water onttrekken uit het staal gebeurt met organische solventen
- daarna wordt het weefsel ingebed in een stevig medium dat snijden mogelijk maakt
- paraffine (= soort kaarsvet) wordt gebruikt bij lichtmicroscopie en voor e-microscopie gebruik je epoxyhars
Om het staal onder de microscoop goed te kunnen bestuderen moet het ook gekleurd worden. Kleuring kan op verschillende manieren:
a) H&E → hematoxyline (+) bindt aan negatief geladen nucleïnezuren (kernen blauw) en eosine (-) bindt aan positief geladen cytoplasma delen
(cytoplasma roos)
b) IHC (ImmunoHistoChemie) → antilichamen herkennen eiwitten. Gelabelde antilichamen (direct of indirect) maken doelwit zichtbaar via
peroxidase of fluoroforen (kan versterkt worden door biotine-streptavidine (geamplificeerde IHC)).
, 2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de staalpreparatie voor histologie. Voor welke
histologische methoden worden deze gebruikt?
Fixatie = proces waarbij weefsel wordt ‘vastgezet’ met fixatief (= sterk water) zodat de structuur blijft
behouden en biologische en metabole processen worden stilgelegd. Bij fixatieproces worden covalente
bindingen gevormd met het eiwit via;
A. Formaldehyde
- Formaldehyde → lichtmicroscopie
- Bindingen vormen tussen eiwitten die dicht bij elkaar liggen.
- Binding N-terminaal van eiwitten = cross-linking
B. Glutaaraldehyde
- Glutaaraldehyde → TEM
- Bevat meerdere reactieve groepen → eiwitten die verder uit elkaar liggen kunnen
binden.
- Sterkere fixatie → ultrastructuur van cellen (zoals membranen en organellen) op zeer hoge
resolutie te bekijken
, 3. Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er gebruikgemaakt van directe, indirecte en
ge-amplificeerde immunohistochemie en immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Bij deze techniek gebruik je antilichamen (immunoglobulinen) om specifieke eiwitten in weefsel zichtbaar te maken.
Een antilichaam heeft
- variabele regio’s (“handjes”) die één specifiek eiwit herkennen.
- constante deel (“voetje”) is overal hetzelfde en kan worden gekoppeld aan een marker (zoals peroxidase en fluorescerende
moleculen)
Door zo’n marker aan het constante deel te hangen, kun je zien waar het antilichaam gebonden is.
A. Directe IHC
- je brengt het gemarkeerde antilichaam op het weefsel aan
- het bindt aan zijn doelwit (bijv. “gele driehoekjes”)
- de marker (peroxidase of fluoroforen) zorgt voor zichtbare kleur of licht
- waar kleur verschijnt, zit het eiwit
- nadelen: duur, tijdrovend en inefficiënt (om elk antilichaam apart te labelen)
B. Indirecte IHC
- tweestapsmethode
- primair antilichaam herkent eerst het doeleiwit in het weefsel (bv. de “gele driehoekjes”)
- secundaire antilichaam herkent de constante-regio van het primaire antilichaam
→ Het secundaire antilichaam bindt aan het primaire, en maakt het signaal zichtbaar.
- voordelen: je moet maar 1 type secundair antilichaam labelen per diersoort + signaalversterking → meerdere secundaire
antilichamen kunnen aan 1 primaire binden → sterker signaal
C. Geamplificeerde IHC
- gebruikt als een cel weinig eiwit bevat
- primaire antilichaam wordt gelabeld met biotine
- streptavidine bindt extreem sterk aan biotine en heeft 4 bindingsplaatsen
- aan streptavidine kunnen opnieuw biotine-gelabelde moleculen binden → een
boomstructuur ontstaat
- aan streptavidine worden fluorescerende moleculen of peroxidase gekoppeld
→ Eén primair antilichaam levert zo veel meer signaal op.
onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
A. Wat kan je onderzoeken? Verschil in werking?
Lichtmicroscopie Elektronenmicroscopie
Resolutie: ~0,2 µm Resolutie: < 0,1 nm (veel hoger)
Laat toe om: Laat toe om:
- Algemene weefselstructuur te bekijken - Ultrastructuur van cellen te bestuderen
- Cellen en celkernen te onderscheiden - Organellen en membranen te zien
- Verschillen tussen normaal en tumorweefsel te zien - Lokalisatie van eiwitten (met goud-gelabelde
(bv. meer kernen) antilichamen)
Typisch gebruik: Typisch gebruik:
- Histologie (H&E kleuring) - Detailstudie van celstructuren
- Diagnose van tumoren op weefselniveau - Membranen en intracellulaire componenten
Werkt met zichtbaar licht. Licht gaat door het weefsel en wordt Werkt met elektronen. Elektronen gaan door het weefsel. De
via lenzen vergroot. detectie is afhankelijk van de dikte van het weefsel en de
aanwezigheid van zware atomen (bv. osmium).
Dun weefsel → veel e- → licht
Dik/zwaar weefsel → weinig e- → donker
, B. Voorbewerking van weefsel
Invriezen (snap/flash-freezen) met vloeibare stikstof en dan kleuren
Het einddoel hierbij is het maken van schijfjes uit tumorstaal, zodat je door 1 schijfje kan kijken met de microscoop. Hierbij moet het schijfje
voor lichtmicroscopie 3-10 μm dun zijn, en voor e-microscopie moet het schijfje <0,1 μm dun zijn.
OF
Staal fixeren (= vastzetten) met fixatief (= sterk water) en dan kleuren
- bij dit proces gaat bv formol ervoor zorgen dat de biologische en metabole processen worden stilgelegd
- eiwitten bestaan uit N – R – COOH (amino- en carboxy-groep)
- bij fixatieproces zullen er covalente bindingen gevormd worden met het eiwit
- door die bindingen te maken worden ze als het ware vastgezet
- dit proces kan een tijdje duren
- formol is ideaal voor lichtmicroscopie, hierdoor worden eiwitten die dicht bij elkaar liggen verbonden
- bij e-microscopie gebruik je beter glutaaraldehyde, deze heeft 4C, itt tot formol die maar 1C heeft → hierdoor kunnen eiwitten die
verder van elkaar liggen ook verbonden worden, de afstand tussen de moleculen die je kan verbinden is dus langer en hierdoor heb
je een stevige fixatie
- water onttrekken uit het staal gebeurt met organische solventen
- daarna wordt het weefsel ingebed in een stevig medium dat snijden mogelijk maakt
- paraffine (= soort kaarsvet) wordt gebruikt bij lichtmicroscopie en voor e-microscopie gebruik je epoxyhars
Om het staal onder de microscoop goed te kunnen bestuderen moet het ook gekleurd worden. Kleuring kan op verschillende manieren:
a) H&E → hematoxyline (+) bindt aan negatief geladen nucleïnezuren (kernen blauw) en eosine (-) bindt aan positief geladen cytoplasma delen
(cytoplasma roos)
b) IHC (ImmunoHistoChemie) → antilichamen herkennen eiwitten. Gelabelde antilichamen (direct of indirect) maken doelwit zichtbaar via
peroxidase of fluoroforen (kan versterkt worden door biotine-streptavidine (geamplificeerde IHC)).
, 2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de staalpreparatie voor histologie. Voor welke
histologische methoden worden deze gebruikt?
Fixatie = proces waarbij weefsel wordt ‘vastgezet’ met fixatief (= sterk water) zodat de structuur blijft
behouden en biologische en metabole processen worden stilgelegd. Bij fixatieproces worden covalente
bindingen gevormd met het eiwit via;
A. Formaldehyde
- Formaldehyde → lichtmicroscopie
- Bindingen vormen tussen eiwitten die dicht bij elkaar liggen.
- Binding N-terminaal van eiwitten = cross-linking
B. Glutaaraldehyde
- Glutaaraldehyde → TEM
- Bevat meerdere reactieve groepen → eiwitten die verder uit elkaar liggen kunnen
binden.
- Sterkere fixatie → ultrastructuur van cellen (zoals membranen en organellen) op zeer hoge
resolutie te bekijken
, 3. Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er gebruikgemaakt van directe, indirecte en
ge-amplificeerde immunohistochemie en immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Bij deze techniek gebruik je antilichamen (immunoglobulinen) om specifieke eiwitten in weefsel zichtbaar te maken.
Een antilichaam heeft
- variabele regio’s (“handjes”) die één specifiek eiwit herkennen.
- constante deel (“voetje”) is overal hetzelfde en kan worden gekoppeld aan een marker (zoals peroxidase en fluorescerende
moleculen)
Door zo’n marker aan het constante deel te hangen, kun je zien waar het antilichaam gebonden is.
A. Directe IHC
- je brengt het gemarkeerde antilichaam op het weefsel aan
- het bindt aan zijn doelwit (bijv. “gele driehoekjes”)
- de marker (peroxidase of fluoroforen) zorgt voor zichtbare kleur of licht
- waar kleur verschijnt, zit het eiwit
- nadelen: duur, tijdrovend en inefficiënt (om elk antilichaam apart te labelen)
B. Indirecte IHC
- tweestapsmethode
- primair antilichaam herkent eerst het doeleiwit in het weefsel (bv. de “gele driehoekjes”)
- secundaire antilichaam herkent de constante-regio van het primaire antilichaam
→ Het secundaire antilichaam bindt aan het primaire, en maakt het signaal zichtbaar.
- voordelen: je moet maar 1 type secundair antilichaam labelen per diersoort + signaalversterking → meerdere secundaire
antilichamen kunnen aan 1 primaire binden → sterker signaal
C. Geamplificeerde IHC
- gebruikt als een cel weinig eiwit bevat
- primaire antilichaam wordt gelabeld met biotine
- streptavidine bindt extreem sterk aan biotine en heeft 4 bindingsplaatsen
- aan streptavidine kunnen opnieuw biotine-gelabelde moleculen binden → een
boomstructuur ontstaat
- aan streptavidine worden fluorescerende moleculen of peroxidase gekoppeld
→ Eén primair antilichaam levert zo veel meer signaal op.
