Histologie examenvragen + antwoorden
1.vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie. Wat kan je met beide
technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methode en
waarom?
Wat kan je onderzoeken + vergelijking
Hoe gedetailleerd je kan zien/onderzoeken, is afhankelijk van de resolutie en de vergrotingsmogelijkheden van de
microscoop
Lichtmicroscopie (LM)
• organen, weefsellagen, celstructuren, celtypen en hun organisatie herkennen – geen virussen, DNA,
ribosomen, celmembranen, … (geen ultrastructuren)
• Resolutie: ~200 nm – want licht heeft langere golflengte
• Vergroting: tot 1.000×
• Levend of gefixeerd weefsel mogelijk
• Uitgezonden straling op weefsel: zichtbaar licht
• Glazen lenzen
• Beeld direct via het oculair verkrijgen op het oog
• Kleuren: de natuurlijke kleuren
• Contrast is te zien door de natuurlijke kleuren, door kleuring of door het weefsel/cellen te merken met
fluorescente moleculen -> dan wel een fluorescentiemicroscoop gebruiken
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
• Ultrastructuur: organellen, membranen, ribosomen, mitochondria, ER, virussen
• Intracellulaire structuren op moleculair niveau
• Resolutie: <0,1 nm
• Vergroting: tot 1.000.000×
• Alleen dood/gefixeerd weefsel (geen levend weefsel)
• Uitgezonden straal op weefsel: elektronen door een vacuum elektronen buis
• Elektromagnetische lenzen
• Beeld wordt via projectie lens geprojecteerd op detectorscherm
• Kleuren: zwart-wit
• Contrast is te zien door de verschillen in elektronendichtheid (hoe densere de structuur, hoe minder
elektronen door, hoe donkerder het beeld) of door kleuring
Weefselvoorbereiding
Stap 1 — Bewaren
door fixatie of invriezen om groei van micro-organismen en afbraak door intrinsieke en externa factoren tegen te gaan.
En het weefsel te bewaren in oorspronkelijke toestand.
Lichtmicroscopie: twee opties
Optie A: Fixeren (met formol/formaldehyde)
• Weefsel onderdompelen in fixatievloeistof met fixator
• Vormt covalente bindingen (crosslinking) met N-terminale groepen van eiwitten
• Eiwitten worden gehecht aan cytoskelet → structuur bewaard
• Enzymen irreversibel geïnactiveerd
• Duur: 2–24 uur (afhankelijk van weefselgrootte en fixator)
• Hoeveelheid fixator: minimaal 5× het volume van het weefsel
• Meest gebruikte fixator: formol (waterige oplossing van formaldehyde)
• Gemakkelijk te stockeren
Optie B: Invriezen
• Weefsel snel invriezen in OCT-oplossing (glycol + bepaalde harsen)
• Invriezen via onderkoeld isopentaan (−150°C)
• Enzymatische processen sterk vertraagd (reversibel -> activiteit hersteld bij 37°C)
, • Geschikt voor kleine weefselstukken
• Procedure: 10–15 minuten
• Moeilijker en duurder te stockeren (speciale diepvriezers, −80°C)
TEM
1e fixatie: glutaaraldehyde (4°C)
• Koude fixatie vereist: weefselverval begint al na enkele minuten
• Snelle fixatie is cruciaal (osmotische zwelling van mitochondria en ER treedt snel op)
Fixatie voor TEM moet snel gebeuren aangezien elk klein detail (van verval) gezien kan worden
• Weefselstuk maximaal 1–2 mm groot
• Zorgt voor sterke fixatie want heeft 4C atomen -> meer en verdere cross-linking aangaan
2e fixatie: osmiumtetroxide (OsO₄)
• Bewaart vetten (oxidatie van onverzadigde vetten)
• OsO₄ is een zwaar metaal → wordt elektronendicht
• Zorgt voor contrast in de TEM-beelden door toevoegen 'gewicht' aan specifieke locaties in het weefsel
Invriezen is ook mogelijk bij TEM
Stap 2 — Inbedden
Weefsel moet ingebed worden (hard genoeg gemaakt) om te kunnen snijden in kleine coupes
Lichtmicroscopie: paraffine-inbedding (alleen na fixeren)
• Paraffine is hydrofoob → eerst water verwijderen uit weefsel
• Stappen: water → alcohol 70% → 100% → tolueen of xyleen om alcohol uit te wassen → vloeibare paraffine
• Paraffine stolt tot een blok → snijklaar
• Na invriezen: geen inbedding nodig → direct snijden
TEM: epoxyhars
• Paraffine is te zacht voor ultradunne TEM-sneden
• Epoxyhars is harder → ultradunne coupes (~1 µm) mogelijk
• Zelfde ontwatering als bij LM (alcohol-reeks) voorafgaand
Stap 3 — Snijden
Het weefsel moet gesneden worden zodat het dun genoeg is om de lichtstralen/elektronenstraal door te laten gaan
en om op de tafel van de microscoop te kunnen monteren
Lichtmicroscopie
• Paraffineblok: snijden met microtoom (stalen mes)
• Dikte: 5–10 µm
• Vriescoupes: snijden met vriesmicrotoom (weefsel blijft bevroren)
• Coupes op draagglaasjes → monteren
TEM
• Snijden met diamantmes of glasmes (epoxyhars is te hard voor staal)
• Dikte: ~1 µm (ultradun)
• Precisie vereist: elk verval is zichtbaar bij deze resolutie
,Stap 4 — Kleuren / contrasteren
Lichtmicroscopie
• Eerst deparaffineren -> Tolueen + dalende gradiënt van alcohol → water (kleurstoffen zijn op waterbasis)
• Kleurtechnieken:
➢ H&E (haematoxyline-eosine): haematoxyline kleurt kernen blauw, eosine kleurt cytoplasma roze → standaardkleuring
➢ Empirische kleuring: aankleuren van specifieke weefselcomponenten
➢ Histochemische kleuring: aantonen van chemische stoffen (bv. vetten, koolhydraten)
➢ Enzymhistochemische kleuring: aantonen van enzymactiviteit
➢ Immunohistochemische kleuring: antistoffen tegen specifieke eiwitten gebruiken
TEM
• OsO₄ (2e fixatie) = eerste contrastbron (zwaar metaal)
• Elektronen worden door het preparaat geschoten
• Dik/elektronendicht gebied → meer verstrooiing van elektronen → donkerder beeld
• Dun gebied → meer elektronen passeren → lichter beeld
• Geen kleurfilm: grijswaarden op gevoelige detectieplaat
• Immunolabeling: antistoffengebonden met goudpartikels (verstrooien elektronen sterk) → zichtbaar als
zwarte puntjes
Waarom verschilt de voorbereiding?
Lichtmicroscopie
• Resolutie laag (~200 nm) → paraffine-inbedding en dikke coupes volstaan
• Fotonen passeren door dikkere coupes
• Kleurstof = contrastbron (zichtbare kleuren)
• Weefselverval minder zichtbaar bij lage resolutie
TEM
• Resolutie extreem hoog (<0,1 nm) → elk detail van weefselverval is zichtbaar
• Elektronen gaan niet door dikke coupes → ultradunne sneden vereist
• Zwaar metaal (OsO₄) = contrastbron (elektronendichtheid)
, 2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de staalpreparatie voor
histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Fixatie => het behouden van de oorspronkelijke toestand van weefsels en cellen, zowel op chemisch als
structureel vlak. Afbraakprocessen door intrinsieke als externe factoren worden zoveel mogelijk afgeremd.
Voordelen fixatie:
• Verkrijgen constante resultaten
• Goede morfologie
• Gemakkelijk te stockeren
Nadelen fixatie:
• Kan lang duren
• Enzymen verliezen activiteit
• DNA en RNA wordt beschadigd
Proces fixatie:
➢ Weefsel wordt ondergedompeld in een fixatievloeistof (buffer + fixator).
De fixator in deze vloeistof kan formaldehyde, glutaaraldehyde, bouin’s (picrinezuur + azijnzuur + form)
of B5 (form + HG zouten) zijn
➢ Er worden covalente bindingen gevormd met de N-terminale groepen van eiwitten: crosslinking
➢ Eiwitten hechten vast aan elkaar en aan het cytoskelet -> structuur blijft bewaard
➢ Enzymen verliezen enzymatische werking
➢ Duur 2-24 uur; afhankelijk van grootte te fixeren materiaal en gebruikte fixatie methode
*De fixator moet minimaal 5 keer het volume van het weefsel zijn
• Formaldehyde wordt gebruikt voor lichtmicroscopie
➢ Behoudt de chemische eigenschappen voor kleuring
➢ Bindt de eiwitten ‘losjes’ (heeft 1C om te binden), behoudt de structuur minder gedetailleerd dan bij gebruik
van glutaaraldehyde
➢ Duurt lang tot weefsel gefixeert is
➢ DNA en RNA crosslinken ook maar genetische analyse is nog mogelijk
• Glutaaraldehyde (4°C) wordt gebruikt voor elektronenmicroscopie
➢ Het is extreem stabiel
➢ Behoudt de structuur heel gedetailleerd samen (kan eiwitten die verder van elkaar liggen samen doen binden
en heeft 4C’s om te binden) , aangezien je met elektronenmicroscopie ook meer gedetailleerd kan kijken in
weefsel/een cel en het geringste weefselverval zichtbaar is
➢ Fixatie gebeurt snel
➢ Tweede fixatie met OsO4 -> fixeert vetten en geeft extra gewicht
1.vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie. Wat kan je met beide
technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methode en
waarom?
Wat kan je onderzoeken + vergelijking
Hoe gedetailleerd je kan zien/onderzoeken, is afhankelijk van de resolutie en de vergrotingsmogelijkheden van de
microscoop
Lichtmicroscopie (LM)
• organen, weefsellagen, celstructuren, celtypen en hun organisatie herkennen – geen virussen, DNA,
ribosomen, celmembranen, … (geen ultrastructuren)
• Resolutie: ~200 nm – want licht heeft langere golflengte
• Vergroting: tot 1.000×
• Levend of gefixeerd weefsel mogelijk
• Uitgezonden straling op weefsel: zichtbaar licht
• Glazen lenzen
• Beeld direct via het oculair verkrijgen op het oog
• Kleuren: de natuurlijke kleuren
• Contrast is te zien door de natuurlijke kleuren, door kleuring of door het weefsel/cellen te merken met
fluorescente moleculen -> dan wel een fluorescentiemicroscoop gebruiken
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
• Ultrastructuur: organellen, membranen, ribosomen, mitochondria, ER, virussen
• Intracellulaire structuren op moleculair niveau
• Resolutie: <0,1 nm
• Vergroting: tot 1.000.000×
• Alleen dood/gefixeerd weefsel (geen levend weefsel)
• Uitgezonden straal op weefsel: elektronen door een vacuum elektronen buis
• Elektromagnetische lenzen
• Beeld wordt via projectie lens geprojecteerd op detectorscherm
• Kleuren: zwart-wit
• Contrast is te zien door de verschillen in elektronendichtheid (hoe densere de structuur, hoe minder
elektronen door, hoe donkerder het beeld) of door kleuring
Weefselvoorbereiding
Stap 1 — Bewaren
door fixatie of invriezen om groei van micro-organismen en afbraak door intrinsieke en externa factoren tegen te gaan.
En het weefsel te bewaren in oorspronkelijke toestand.
Lichtmicroscopie: twee opties
Optie A: Fixeren (met formol/formaldehyde)
• Weefsel onderdompelen in fixatievloeistof met fixator
• Vormt covalente bindingen (crosslinking) met N-terminale groepen van eiwitten
• Eiwitten worden gehecht aan cytoskelet → structuur bewaard
• Enzymen irreversibel geïnactiveerd
• Duur: 2–24 uur (afhankelijk van weefselgrootte en fixator)
• Hoeveelheid fixator: minimaal 5× het volume van het weefsel
• Meest gebruikte fixator: formol (waterige oplossing van formaldehyde)
• Gemakkelijk te stockeren
Optie B: Invriezen
• Weefsel snel invriezen in OCT-oplossing (glycol + bepaalde harsen)
• Invriezen via onderkoeld isopentaan (−150°C)
• Enzymatische processen sterk vertraagd (reversibel -> activiteit hersteld bij 37°C)
, • Geschikt voor kleine weefselstukken
• Procedure: 10–15 minuten
• Moeilijker en duurder te stockeren (speciale diepvriezers, −80°C)
TEM
1e fixatie: glutaaraldehyde (4°C)
• Koude fixatie vereist: weefselverval begint al na enkele minuten
• Snelle fixatie is cruciaal (osmotische zwelling van mitochondria en ER treedt snel op)
Fixatie voor TEM moet snel gebeuren aangezien elk klein detail (van verval) gezien kan worden
• Weefselstuk maximaal 1–2 mm groot
• Zorgt voor sterke fixatie want heeft 4C atomen -> meer en verdere cross-linking aangaan
2e fixatie: osmiumtetroxide (OsO₄)
• Bewaart vetten (oxidatie van onverzadigde vetten)
• OsO₄ is een zwaar metaal → wordt elektronendicht
• Zorgt voor contrast in de TEM-beelden door toevoegen 'gewicht' aan specifieke locaties in het weefsel
Invriezen is ook mogelijk bij TEM
Stap 2 — Inbedden
Weefsel moet ingebed worden (hard genoeg gemaakt) om te kunnen snijden in kleine coupes
Lichtmicroscopie: paraffine-inbedding (alleen na fixeren)
• Paraffine is hydrofoob → eerst water verwijderen uit weefsel
• Stappen: water → alcohol 70% → 100% → tolueen of xyleen om alcohol uit te wassen → vloeibare paraffine
• Paraffine stolt tot een blok → snijklaar
• Na invriezen: geen inbedding nodig → direct snijden
TEM: epoxyhars
• Paraffine is te zacht voor ultradunne TEM-sneden
• Epoxyhars is harder → ultradunne coupes (~1 µm) mogelijk
• Zelfde ontwatering als bij LM (alcohol-reeks) voorafgaand
Stap 3 — Snijden
Het weefsel moet gesneden worden zodat het dun genoeg is om de lichtstralen/elektronenstraal door te laten gaan
en om op de tafel van de microscoop te kunnen monteren
Lichtmicroscopie
• Paraffineblok: snijden met microtoom (stalen mes)
• Dikte: 5–10 µm
• Vriescoupes: snijden met vriesmicrotoom (weefsel blijft bevroren)
• Coupes op draagglaasjes → monteren
TEM
• Snijden met diamantmes of glasmes (epoxyhars is te hard voor staal)
• Dikte: ~1 µm (ultradun)
• Precisie vereist: elk verval is zichtbaar bij deze resolutie
,Stap 4 — Kleuren / contrasteren
Lichtmicroscopie
• Eerst deparaffineren -> Tolueen + dalende gradiënt van alcohol → water (kleurstoffen zijn op waterbasis)
• Kleurtechnieken:
➢ H&E (haematoxyline-eosine): haematoxyline kleurt kernen blauw, eosine kleurt cytoplasma roze → standaardkleuring
➢ Empirische kleuring: aankleuren van specifieke weefselcomponenten
➢ Histochemische kleuring: aantonen van chemische stoffen (bv. vetten, koolhydraten)
➢ Enzymhistochemische kleuring: aantonen van enzymactiviteit
➢ Immunohistochemische kleuring: antistoffen tegen specifieke eiwitten gebruiken
TEM
• OsO₄ (2e fixatie) = eerste contrastbron (zwaar metaal)
• Elektronen worden door het preparaat geschoten
• Dik/elektronendicht gebied → meer verstrooiing van elektronen → donkerder beeld
• Dun gebied → meer elektronen passeren → lichter beeld
• Geen kleurfilm: grijswaarden op gevoelige detectieplaat
• Immunolabeling: antistoffengebonden met goudpartikels (verstrooien elektronen sterk) → zichtbaar als
zwarte puntjes
Waarom verschilt de voorbereiding?
Lichtmicroscopie
• Resolutie laag (~200 nm) → paraffine-inbedding en dikke coupes volstaan
• Fotonen passeren door dikkere coupes
• Kleurstof = contrastbron (zichtbare kleuren)
• Weefselverval minder zichtbaar bij lage resolutie
TEM
• Resolutie extreem hoog (<0,1 nm) → elk detail van weefselverval is zichtbaar
• Elektronen gaan niet door dikke coupes → ultradunne sneden vereist
• Zwaar metaal (OsO₄) = contrastbron (elektronendichtheid)
, 2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de staalpreparatie voor
histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Fixatie => het behouden van de oorspronkelijke toestand van weefsels en cellen, zowel op chemisch als
structureel vlak. Afbraakprocessen door intrinsieke als externe factoren worden zoveel mogelijk afgeremd.
Voordelen fixatie:
• Verkrijgen constante resultaten
• Goede morfologie
• Gemakkelijk te stockeren
Nadelen fixatie:
• Kan lang duren
• Enzymen verliezen activiteit
• DNA en RNA wordt beschadigd
Proces fixatie:
➢ Weefsel wordt ondergedompeld in een fixatievloeistof (buffer + fixator).
De fixator in deze vloeistof kan formaldehyde, glutaaraldehyde, bouin’s (picrinezuur + azijnzuur + form)
of B5 (form + HG zouten) zijn
➢ Er worden covalente bindingen gevormd met de N-terminale groepen van eiwitten: crosslinking
➢ Eiwitten hechten vast aan elkaar en aan het cytoskelet -> structuur blijft bewaard
➢ Enzymen verliezen enzymatische werking
➢ Duur 2-24 uur; afhankelijk van grootte te fixeren materiaal en gebruikte fixatie methode
*De fixator moet minimaal 5 keer het volume van het weefsel zijn
• Formaldehyde wordt gebruikt voor lichtmicroscopie
➢ Behoudt de chemische eigenschappen voor kleuring
➢ Bindt de eiwitten ‘losjes’ (heeft 1C om te binden), behoudt de structuur minder gedetailleerd dan bij gebruik
van glutaaraldehyde
➢ Duurt lang tot weefsel gefixeert is
➢ DNA en RNA crosslinken ook maar genetische analyse is nog mogelijk
• Glutaaraldehyde (4°C) wordt gebruikt voor elektronenmicroscopie
➢ Het is extreem stabiel
➢ Behoudt de structuur heel gedetailleerd samen (kan eiwitten die verder van elkaar liggen samen doen binden
en heeft 4C’s om te binden) , aangezien je met elektronenmicroscopie ook meer gedetailleerd kan kijken in
weefsel/een cel en het geringste weefselverval zichtbaar is
➢ Fixatie gebeurt snel
➢ Tweede fixatie met OsO4 -> fixeert vetten en geeft extra gewicht
