1. Nucleus — genoom 3D organisatie
1.1. Inleiding
❉ Inmiddels is geweten dat DNA expressie geen 1D proces is, waarbij een transcriptiefactor bindt aan
DNA met als gevolg een gen dat aan/uit staat
❉ Maar de nucleus is een 3D magazijn waarbij 1000’en genen tegelijkertijd aan/uit staan
❉ Structuur van DNA/genoom of chromatine opvouwing is cruciaal voor de werking van magazijn
✳ Genoom organisatie in levercel, spiercel, hersencel… verschillen van elkaar doordat ze andere
bouwstenen nodig hebben en andere metabole pathways moeten aansturen
1.2. Nucleaire compartimentalisatie
1.2.1. Waarom moet het genoom in 3D georganiseerd zijn?
❉ De hoeveelheid genetisch info sinds de bacteriën/algen tot nu de mens, is gigantisch toegenomen
✳ Eukaryote genomen = 1000X genoom bacteria
✳ Eukaryote genomen bevatten veel regulatorisch DNA/RNA
✳ Eukaryote genomen coderen voor multicellulaire ontwikkeling
❉ Grote hoeveelheid genetisch informatie maakt DNA ook meer kwetsbaar
✳ Moet zodanig georganiseerd wordt dat het zowel beschermt als toegankelijk is
1.2.2. Nucleus
❉ M.b.v. fluorescente groepen, kan gezien worden dat de celkern een wirwar van structuren lijkt te
bevatten die doet denken aan een bord spaghetti
✳ Oorspronkelijk dacht men dat deze random georganiseerd was
✳ Tegenwoordig meer methodes om opname te nemen van toestand op een bep. moment
✳ We kunnen vers. fase i.f.v. de tijd bekijken en zien of de structuur verandert
✳ Resultaat: het lijkt alsof elk chromosoom zijn eigen territorium heeft maar dat er ook overlap is (=
chromosome kissing)
⋇ Overlap zorgt ervoor dat er co-regulatie kan optreden van genen die op verschillende
chromosomen liggen
❉ Gen expressie gebeurt dus niet random
1.2.3. Organisatieniveaus
❉ DNA is een dubbele helix en wordt gewikkeld rond histonen = nucleosomen (
✳ Afstand tussen 2 opeenvolgende histonen bepaald of het een actieve of inactieve regio is
✳ Bepalen voor een stuk hoe het DNA lussen zal vormen
❉ Bepaalde domeinen kunnen samenkomen en uitstulpingen vormen = lus structuren
✳ Lus structuren die zich in een bubbel organiseren = topologisch geassocieerde domeinen (TAD’s)
⋇ Zijn co-gereguleerde genen van hetzelfde chromosoom of tussen verschillende chromosomen
❉ We hebben ook andere soort domeinen: lamine geassocieerde domeinen (LAD’s)
✳ Deze kunnen ook lusstructuren zijn met een andere dichtheid of viscositeit
✳ Zitten vaak in de periferie van de kern, tegen de nucleaire membraan
⋇ Constitutionele LAD’s: domeinen van genen die niet meer tot expressie komen (bv. HOX genen)
⋇ Facultatieve LAD’s: domeinen die op vraag actief zijn (bv. genen betrokken bij ontsteking of DNA
herstel)
✳ Sommige LAD’s kunnen vrijkomen wanneer ze actief worden en TAD’s worden
❉ Heel dynamisch proces dus!
P a g i n a 1 | 58
,1.2.4. Wat bepaald de TAD en LAD domeinen?
❉ De nucleosomen kunnen gezien worden als magneten waarbij positieve polen elkaar afstoten en
tegengestelde elkaar aantrekken
✳ Men had ook gezien dat wanneer het meer geacetyleerd wordt, het meer negatief werd terwijl
wanneer het minder geacetyleerd wordt, werd het meer positief
❉ Densiteit van celkern is niet homogeen
✳ Je hebt verschillende gradaties van viscositeit
✳ D.w.z. dat we de lading van nucleosomen kunnen veranderen maar ook de hydrofobiciteit
⋇ Door vetmoleculen aan nucleosoom te hangen, worden ze meer hydrofoob
⋇ Men spreekt daarom ook van fase transitie in de celkern
⤷ Celkern kan gezien worden als een emulsie van allerlei druppels van transcriptiefactoren die
allemaal verschillende eigenschappen hebben van hydrofobiciteit en hydrofiliciteit
⤷ Nucleosomen met dezelfde hydrofobiciteit en hydrofiliciteit zitten in eenzelfde
druppel/bubbel
1.3. Nucleaire fluïditeit: chromatine fase separatie
1.3.1. Chromatinestructuur regelt faseveranderingen in fluïditeit
❉ In de celkern zijn er faseverschillen, meer bepaald een gradiënt van hydrofobiciteit, viscositeit…
✳ Gevolg: unieke eigenschappen + door compartimentalisatie krijgen we domeinen die bepaalde
biologisch/biochemische processen te regelen
❉ Bij verschillende stress condities zien we bij de microscopie stress granules (=speckles)
✳ I.p.v. een homogene kleur zien we punten → kunnen transcriptie of splicing factoren zijn
✳ De densiteit van de speckles kan een kristalachtige structuur zijn tot flexibele regio’s
⤀Er is dus continu bubbel reorganisatie in de celkern die verantwoordelijk zijn voor de TAD en LAD
organisatie die op hun beurt verantwoordelijk zijn voor het 3D genoom organisatie
1.3.2. Chromatinestructuur regelt faseveranderingen in transcription factories
❉ Transcriptie activiteit in de celkern:
✳ In de lamine geassocieerde domeinen (LAD’s) = gen repressie
⋇ Bevinden zich aan de buitenkant
✳ In de topologische geassocieerde domeinen (TAD’s) = gen expressie
⋇ Bevinden zich in het centrum van de celkern
1.3.3. Distributie van genrijke en genarme regio’s in nucleus is niet homogeen
❉ Vroeger voor men aan fluorescentie deed, gebruikte men kleurstoffen
✳ Men zag dat een hepatocyt, die hard werkt om leverfactoren te produceren, wit
kleurde terwijl een lymfocyt die in een slapende toestand is tot bij een
ontsteking, zwart keurde
⋇ Witte kleur = euchromatine
⋇ Zwarte kleur = hetrochromatine
⤀De ratio euchromaine/hetrochromatine is gecorreleerd met de biosynthese status
van de cel
❉ Bij het gebruiken van fluorescente probes die specifiek zijn voor elke
chromosoom, zien we dat naast de gradiënt van niet actief naar actief chromatine,
elke chromosoom een eigen plaats heeft in de celkern
P a g i n a 2 | 58
, 1.4. Genoom opvouwing 3D: TADs, LADs
1.4.1. Nucleaire subcompartimentalisatie van actieve genoomdomeinen via lussen
❉ Analyse van genoomarchitectuur kan via 3C technologie
✳ 3C technologie = chromosoom conformatie capture technologie
✳ Hierbij wordt de structuur van elke chromosoom gecapteerd
❉ De plaats waar 2 lussen samenkomen, worden typisch gebonden door eiwitten (histonen of TF)
✳ Vervolgens zal door behandeling formaldehyde eiwit gecross-linkt worden aan DNA
✳ Daarna wordt een restrictie-enzym toegevoegd met de vorming van sticky ends
✳ DNA ligase zal de sticky ends aan elkaar ligeren
⋇ Hierbij is intramoleculaire regulatie veel efficiënter als de intermoleculaire
✳ Vervolgens zal het geheel verhit worden, waarbij het eiwit verloren gaat
⤀Resultaat: DNA streng waarbij de 2 lussen aan elkaar geligeerd zijn
OPMERKING
❉ Om te zien of er chromosome kissing is, moest je 2 primers kiezen voor beide chromosomen en
zien of je een amplicon krijgt → arbeidsintensief
❉ Tegenwoordig kunnen we via NGS alle fragmenten sequeneren en kijken vanwaar ze komen
1.4.2. HiC analysemethode voor identificeren van chromosoomcontacten
① Principe
❉ De DNA sequentie van alle chromosomen worden horizontaal en verticaal uitgezet in
een grafiek
✳ Daarbij kan gezien wordt dat veel fragmenten van chromosoom 1 zullen kleven aan
fragmenten van chromosoom 1 = intrachromosomale contacten
⋇ Toch zullen sommige DNA fragmenten van chromosoom 1 maken ook contact
met andere chromosomen
❉ Wanneer dit gedaan wordt in voldoende cellen (= voldoende coverage), zal je kunnen
inzoomen
✳ Wordt ook wel HiC genoemd
✳ Ook wanneeer je inzoomt, zal je een raster patroon hebben
❉ Je kan steeds dieper en dieper inzoomt, tot een bijna op gen niveau om te zien welke
enhancers met elkaar in contact komen
✳ Wanneer we de vierkante grafiek in 2 knippen en kantelen, krijgen we een
driehoekige grafiek waarin allerlei driehoeken in zitten
✳ Elke driehoek, wordt een topololoigsch geassocieerd domein (TAD) genoemd
❉ 3C, 4C en 5C technologie zijn achterhaald geweest en nu doet men aan HiC
✳ 3C was met PCR amplificiatie
✳ 4C heeft nog een extra restrictie digestie stap, waarna ligatie volgt en PCR amplificatie
⤀HiC = high fidelity conformatie capture technologie
✳ Hierbij zullen alle fragmenten immunoprecipiteert worden met een biotine tag
P a g i n a 3 | 58
, ② S chematisch
1.4.3. Topological associated domain TAD: cruciaal in ontwikkelingsbiologie
❉ Bij een aantal syndromen waar er defecten waren (bv. vinger teveel), heeft men de genen in kaart
gebracht
✳ Gevolg: men zag dat er problemen waren met de TAD domeinen (bv. achterste voren of extra
driehoek/TAD aanwezig) → TAD domeinen hebben zich daardoor niet goed kunnen vormen of
clusters wordt niet correct gecoreguleerd
P a g i n a 4 | 58
1.1. Inleiding
❉ Inmiddels is geweten dat DNA expressie geen 1D proces is, waarbij een transcriptiefactor bindt aan
DNA met als gevolg een gen dat aan/uit staat
❉ Maar de nucleus is een 3D magazijn waarbij 1000’en genen tegelijkertijd aan/uit staan
❉ Structuur van DNA/genoom of chromatine opvouwing is cruciaal voor de werking van magazijn
✳ Genoom organisatie in levercel, spiercel, hersencel… verschillen van elkaar doordat ze andere
bouwstenen nodig hebben en andere metabole pathways moeten aansturen
1.2. Nucleaire compartimentalisatie
1.2.1. Waarom moet het genoom in 3D georganiseerd zijn?
❉ De hoeveelheid genetisch info sinds de bacteriën/algen tot nu de mens, is gigantisch toegenomen
✳ Eukaryote genomen = 1000X genoom bacteria
✳ Eukaryote genomen bevatten veel regulatorisch DNA/RNA
✳ Eukaryote genomen coderen voor multicellulaire ontwikkeling
❉ Grote hoeveelheid genetisch informatie maakt DNA ook meer kwetsbaar
✳ Moet zodanig georganiseerd wordt dat het zowel beschermt als toegankelijk is
1.2.2. Nucleus
❉ M.b.v. fluorescente groepen, kan gezien worden dat de celkern een wirwar van structuren lijkt te
bevatten die doet denken aan een bord spaghetti
✳ Oorspronkelijk dacht men dat deze random georganiseerd was
✳ Tegenwoordig meer methodes om opname te nemen van toestand op een bep. moment
✳ We kunnen vers. fase i.f.v. de tijd bekijken en zien of de structuur verandert
✳ Resultaat: het lijkt alsof elk chromosoom zijn eigen territorium heeft maar dat er ook overlap is (=
chromosome kissing)
⋇ Overlap zorgt ervoor dat er co-regulatie kan optreden van genen die op verschillende
chromosomen liggen
❉ Gen expressie gebeurt dus niet random
1.2.3. Organisatieniveaus
❉ DNA is een dubbele helix en wordt gewikkeld rond histonen = nucleosomen (
✳ Afstand tussen 2 opeenvolgende histonen bepaald of het een actieve of inactieve regio is
✳ Bepalen voor een stuk hoe het DNA lussen zal vormen
❉ Bepaalde domeinen kunnen samenkomen en uitstulpingen vormen = lus structuren
✳ Lus structuren die zich in een bubbel organiseren = topologisch geassocieerde domeinen (TAD’s)
⋇ Zijn co-gereguleerde genen van hetzelfde chromosoom of tussen verschillende chromosomen
❉ We hebben ook andere soort domeinen: lamine geassocieerde domeinen (LAD’s)
✳ Deze kunnen ook lusstructuren zijn met een andere dichtheid of viscositeit
✳ Zitten vaak in de periferie van de kern, tegen de nucleaire membraan
⋇ Constitutionele LAD’s: domeinen van genen die niet meer tot expressie komen (bv. HOX genen)
⋇ Facultatieve LAD’s: domeinen die op vraag actief zijn (bv. genen betrokken bij ontsteking of DNA
herstel)
✳ Sommige LAD’s kunnen vrijkomen wanneer ze actief worden en TAD’s worden
❉ Heel dynamisch proces dus!
P a g i n a 1 | 58
,1.2.4. Wat bepaald de TAD en LAD domeinen?
❉ De nucleosomen kunnen gezien worden als magneten waarbij positieve polen elkaar afstoten en
tegengestelde elkaar aantrekken
✳ Men had ook gezien dat wanneer het meer geacetyleerd wordt, het meer negatief werd terwijl
wanneer het minder geacetyleerd wordt, werd het meer positief
❉ Densiteit van celkern is niet homogeen
✳ Je hebt verschillende gradaties van viscositeit
✳ D.w.z. dat we de lading van nucleosomen kunnen veranderen maar ook de hydrofobiciteit
⋇ Door vetmoleculen aan nucleosoom te hangen, worden ze meer hydrofoob
⋇ Men spreekt daarom ook van fase transitie in de celkern
⤷ Celkern kan gezien worden als een emulsie van allerlei druppels van transcriptiefactoren die
allemaal verschillende eigenschappen hebben van hydrofobiciteit en hydrofiliciteit
⤷ Nucleosomen met dezelfde hydrofobiciteit en hydrofiliciteit zitten in eenzelfde
druppel/bubbel
1.3. Nucleaire fluïditeit: chromatine fase separatie
1.3.1. Chromatinestructuur regelt faseveranderingen in fluïditeit
❉ In de celkern zijn er faseverschillen, meer bepaald een gradiënt van hydrofobiciteit, viscositeit…
✳ Gevolg: unieke eigenschappen + door compartimentalisatie krijgen we domeinen die bepaalde
biologisch/biochemische processen te regelen
❉ Bij verschillende stress condities zien we bij de microscopie stress granules (=speckles)
✳ I.p.v. een homogene kleur zien we punten → kunnen transcriptie of splicing factoren zijn
✳ De densiteit van de speckles kan een kristalachtige structuur zijn tot flexibele regio’s
⤀Er is dus continu bubbel reorganisatie in de celkern die verantwoordelijk zijn voor de TAD en LAD
organisatie die op hun beurt verantwoordelijk zijn voor het 3D genoom organisatie
1.3.2. Chromatinestructuur regelt faseveranderingen in transcription factories
❉ Transcriptie activiteit in de celkern:
✳ In de lamine geassocieerde domeinen (LAD’s) = gen repressie
⋇ Bevinden zich aan de buitenkant
✳ In de topologische geassocieerde domeinen (TAD’s) = gen expressie
⋇ Bevinden zich in het centrum van de celkern
1.3.3. Distributie van genrijke en genarme regio’s in nucleus is niet homogeen
❉ Vroeger voor men aan fluorescentie deed, gebruikte men kleurstoffen
✳ Men zag dat een hepatocyt, die hard werkt om leverfactoren te produceren, wit
kleurde terwijl een lymfocyt die in een slapende toestand is tot bij een
ontsteking, zwart keurde
⋇ Witte kleur = euchromatine
⋇ Zwarte kleur = hetrochromatine
⤀De ratio euchromaine/hetrochromatine is gecorreleerd met de biosynthese status
van de cel
❉ Bij het gebruiken van fluorescente probes die specifiek zijn voor elke
chromosoom, zien we dat naast de gradiënt van niet actief naar actief chromatine,
elke chromosoom een eigen plaats heeft in de celkern
P a g i n a 2 | 58
, 1.4. Genoom opvouwing 3D: TADs, LADs
1.4.1. Nucleaire subcompartimentalisatie van actieve genoomdomeinen via lussen
❉ Analyse van genoomarchitectuur kan via 3C technologie
✳ 3C technologie = chromosoom conformatie capture technologie
✳ Hierbij wordt de structuur van elke chromosoom gecapteerd
❉ De plaats waar 2 lussen samenkomen, worden typisch gebonden door eiwitten (histonen of TF)
✳ Vervolgens zal door behandeling formaldehyde eiwit gecross-linkt worden aan DNA
✳ Daarna wordt een restrictie-enzym toegevoegd met de vorming van sticky ends
✳ DNA ligase zal de sticky ends aan elkaar ligeren
⋇ Hierbij is intramoleculaire regulatie veel efficiënter als de intermoleculaire
✳ Vervolgens zal het geheel verhit worden, waarbij het eiwit verloren gaat
⤀Resultaat: DNA streng waarbij de 2 lussen aan elkaar geligeerd zijn
OPMERKING
❉ Om te zien of er chromosome kissing is, moest je 2 primers kiezen voor beide chromosomen en
zien of je een amplicon krijgt → arbeidsintensief
❉ Tegenwoordig kunnen we via NGS alle fragmenten sequeneren en kijken vanwaar ze komen
1.4.2. HiC analysemethode voor identificeren van chromosoomcontacten
① Principe
❉ De DNA sequentie van alle chromosomen worden horizontaal en verticaal uitgezet in
een grafiek
✳ Daarbij kan gezien wordt dat veel fragmenten van chromosoom 1 zullen kleven aan
fragmenten van chromosoom 1 = intrachromosomale contacten
⋇ Toch zullen sommige DNA fragmenten van chromosoom 1 maken ook contact
met andere chromosomen
❉ Wanneer dit gedaan wordt in voldoende cellen (= voldoende coverage), zal je kunnen
inzoomen
✳ Wordt ook wel HiC genoemd
✳ Ook wanneeer je inzoomt, zal je een raster patroon hebben
❉ Je kan steeds dieper en dieper inzoomt, tot een bijna op gen niveau om te zien welke
enhancers met elkaar in contact komen
✳ Wanneer we de vierkante grafiek in 2 knippen en kantelen, krijgen we een
driehoekige grafiek waarin allerlei driehoeken in zitten
✳ Elke driehoek, wordt een topololoigsch geassocieerd domein (TAD) genoemd
❉ 3C, 4C en 5C technologie zijn achterhaald geweest en nu doet men aan HiC
✳ 3C was met PCR amplificiatie
✳ 4C heeft nog een extra restrictie digestie stap, waarna ligatie volgt en PCR amplificatie
⤀HiC = high fidelity conformatie capture technologie
✳ Hierbij zullen alle fragmenten immunoprecipiteert worden met een biotine tag
P a g i n a 3 | 58
, ② S chematisch
1.4.3. Topological associated domain TAD: cruciaal in ontwikkelingsbiologie
❉ Bij een aantal syndromen waar er defecten waren (bv. vinger teveel), heeft men de genen in kaart
gebracht
✳ Gevolg: men zag dat er problemen waren met de TAD domeinen (bv. achterste voren of extra
driehoek/TAD aanwezig) → TAD domeinen hebben zich daardoor niet goed kunnen vormen of
clusters wordt niet correct gecoreguleerd
P a g i n a 4 | 58
