Leerdoelen: Practicum Neuronale Aandoeningen
Leerdoel: Je kent de modelsystemen en technieken die we tijdens het practicum hebben gebruikt en/of die voor het voorwerk zijn gebruikt.
Antwoord: Tijdens het practicum gebruikten we drie verschillende modelsystemen:
A. Primaire rattenneuronen (Experiment A):
• Herkomst: E18,5 rattenembryo’s (cortex).
• Toepassing: transfectie met DNA-plasmiden (wildtype of mutant eiwitX).
• Doel: functie van eiwitX bestuderen in volwassen neuronen (DIV21).
B. Primaire muisneuronen van KI-muizen (Experiment B):
• Herkomst: hippocampus van E17,5 KI-embryo’s.
• Toepassing: bestuderen van neuronale polarisatie en axonvorming.
• Genetische achtergrond: heterozygote KI (ki/wt) versus wildtype (wt/wt).
C. Conditionele KO-muizen (Experiment C):
• Herkomst: E17,5 embryo’s, hersenen gefixeerd en in cryocoupes gesneden.
• Genotype: fl/fl;Cre/wt (cKO) versus fl/fl;wt/wt (controle).
• Doel: corticale ontwikkeling en neuronale migratie bestuderen.
Technieken:
• ICC (immunocytochemie) voor gekweekte neuronen.
• IHC (immunohistochemie) voor hersencoupes.
• Genotypering (PCR + gel-elektroforese).
• Confocale microscopie.
• DNA-transfectie (lipofectamine).
• Cryosectie en fixatie.
Leerdoel: Je hebt kennis over de modelsystemen met die je tijdens het practicum hebt gewerkt.
Antwoord:
Primaire neuronen:
• Direct uit hersenweefsel geïsoleerd → fysiologisch relevant.
• Corticale neuronen (rat) voor synapsvorming (Experiment A).
• Hippocampale neuronen (muis) voor polarisatie (Experiment B).
Knock-in muizen:
• Gen gemodificeerd door een specifieke puntmutatie in het endogene locus.
• Modelleert menselijke ziekte-mutaties.
• Heterozygote KI’s zijn levensvatbaar → geschikt voor neuronale kweek.
Conditionele knock-out muizen:
• Floxed allel (fl/fl) × Cre-driver (Nex-Cre).
• Nex-Cre → KO alleen in Nex-positieve neuronen (postmitotische excitatoire neuronen).
• Voorkomt lethale fenotypes van globale KO’s.
• Gebruikt voor corticale laagvorming (Experiment C).
Leerdoel: Je kunt beschrijven hoe hersencoupes tot stand komen.
Antwoord:
1. Embryo’s worden gedood en hersenen geïsoleerd.
2. Fixatie in 4% PFA (4,5 uur).
3. Cryoprotectie in 30% sucrose (overnight).
4. Inbedden in OCT/embedding medium.
5. Invriezen op -80°C.
6. Snijden met cryostaat op -33°C in 12 µm dikke coupes.
7. Coups op objectglaasjes verzamelen en bewaren.
1
, Leerdoel: Je kunt beschrijven hoe je een ICC of IHC experiment uitvoert (welke stappen) en wat je ermee kan bepalen.
Antwoord:
Stappen:
1. Fixatie:
• PFA → crosslinkt eiwitten, stabiliseert cellen.
2. Permeabilisatie:
• Triton-X (0,1–0,2%) → maakt membranen poreus zodat antilichamen binnenkomen.
3. Blokken:
• 10% NGS → voorkomt niet-specifieke binding.
4. Incubatie met primaire antilichamen:
• Binden specifiek aan het eiwit van interesse.
5. Wassen:
• Verwijdert ongebonde antilichamen.
6. Incubatie met secundaire antilichamen:
• Herkennen species van primair antilichaam (bijv. goat-anti-rabbit).
• Zijn fluorescent gelabeld → zichtbaar onder microscoop.
7. Mounting:
• Vectashield (zonder DAPI) + coverslip.
Wat kun je ermee bepalen?
• Lokalisatie van eiwitten.
• Aanwezigheid/afwezigheid van structuren.
• Morfologie van neuronen.
Wat kun je NIET bepalen?
• Functionele activiteit van eiwitten.
• Dynamiek in levende cellen.
• Genexpressieniveaus (alleen eiwitlokalisatie).
Leerdoel: Je kent de ‘markers’ die in het practicum zijn gebruikt/in de handleiding staan.
Antwoord:
Algemene markers:
• DAPI → celkernen.
• MAP2 → dendrieten.
• Tau → axonen.
• Synapsin / PSD-95 → synapsen.
• Tuj1 (βIII-tubulin) → neuronen.
Corticogenese (Experiment C):
• Satb2 → lagen II–IV (post-mitotisch; upper layers).
• Cux1 → lagen II–IV.
• Ctip2 → lagen V.
• Tbr1 → laag VI.
• Tbr2 → SVZ (intermediaire progenitorcellen).
• NF → axonen.
2
Leerdoel: Je kent de modelsystemen en technieken die we tijdens het practicum hebben gebruikt en/of die voor het voorwerk zijn gebruikt.
Antwoord: Tijdens het practicum gebruikten we drie verschillende modelsystemen:
A. Primaire rattenneuronen (Experiment A):
• Herkomst: E18,5 rattenembryo’s (cortex).
• Toepassing: transfectie met DNA-plasmiden (wildtype of mutant eiwitX).
• Doel: functie van eiwitX bestuderen in volwassen neuronen (DIV21).
B. Primaire muisneuronen van KI-muizen (Experiment B):
• Herkomst: hippocampus van E17,5 KI-embryo’s.
• Toepassing: bestuderen van neuronale polarisatie en axonvorming.
• Genetische achtergrond: heterozygote KI (ki/wt) versus wildtype (wt/wt).
C. Conditionele KO-muizen (Experiment C):
• Herkomst: E17,5 embryo’s, hersenen gefixeerd en in cryocoupes gesneden.
• Genotype: fl/fl;Cre/wt (cKO) versus fl/fl;wt/wt (controle).
• Doel: corticale ontwikkeling en neuronale migratie bestuderen.
Technieken:
• ICC (immunocytochemie) voor gekweekte neuronen.
• IHC (immunohistochemie) voor hersencoupes.
• Genotypering (PCR + gel-elektroforese).
• Confocale microscopie.
• DNA-transfectie (lipofectamine).
• Cryosectie en fixatie.
Leerdoel: Je hebt kennis over de modelsystemen met die je tijdens het practicum hebt gewerkt.
Antwoord:
Primaire neuronen:
• Direct uit hersenweefsel geïsoleerd → fysiologisch relevant.
• Corticale neuronen (rat) voor synapsvorming (Experiment A).
• Hippocampale neuronen (muis) voor polarisatie (Experiment B).
Knock-in muizen:
• Gen gemodificeerd door een specifieke puntmutatie in het endogene locus.
• Modelleert menselijke ziekte-mutaties.
• Heterozygote KI’s zijn levensvatbaar → geschikt voor neuronale kweek.
Conditionele knock-out muizen:
• Floxed allel (fl/fl) × Cre-driver (Nex-Cre).
• Nex-Cre → KO alleen in Nex-positieve neuronen (postmitotische excitatoire neuronen).
• Voorkomt lethale fenotypes van globale KO’s.
• Gebruikt voor corticale laagvorming (Experiment C).
Leerdoel: Je kunt beschrijven hoe hersencoupes tot stand komen.
Antwoord:
1. Embryo’s worden gedood en hersenen geïsoleerd.
2. Fixatie in 4% PFA (4,5 uur).
3. Cryoprotectie in 30% sucrose (overnight).
4. Inbedden in OCT/embedding medium.
5. Invriezen op -80°C.
6. Snijden met cryostaat op -33°C in 12 µm dikke coupes.
7. Coups op objectglaasjes verzamelen en bewaren.
1
, Leerdoel: Je kunt beschrijven hoe je een ICC of IHC experiment uitvoert (welke stappen) en wat je ermee kan bepalen.
Antwoord:
Stappen:
1. Fixatie:
• PFA → crosslinkt eiwitten, stabiliseert cellen.
2. Permeabilisatie:
• Triton-X (0,1–0,2%) → maakt membranen poreus zodat antilichamen binnenkomen.
3. Blokken:
• 10% NGS → voorkomt niet-specifieke binding.
4. Incubatie met primaire antilichamen:
• Binden specifiek aan het eiwit van interesse.
5. Wassen:
• Verwijdert ongebonde antilichamen.
6. Incubatie met secundaire antilichamen:
• Herkennen species van primair antilichaam (bijv. goat-anti-rabbit).
• Zijn fluorescent gelabeld → zichtbaar onder microscoop.
7. Mounting:
• Vectashield (zonder DAPI) + coverslip.
Wat kun je ermee bepalen?
• Lokalisatie van eiwitten.
• Aanwezigheid/afwezigheid van structuren.
• Morfologie van neuronen.
Wat kun je NIET bepalen?
• Functionele activiteit van eiwitten.
• Dynamiek in levende cellen.
• Genexpressieniveaus (alleen eiwitlokalisatie).
Leerdoel: Je kent de ‘markers’ die in het practicum zijn gebruikt/in de handleiding staan.
Antwoord:
Algemene markers:
• DAPI → celkernen.
• MAP2 → dendrieten.
• Tau → axonen.
• Synapsin / PSD-95 → synapsen.
• Tuj1 (βIII-tubulin) → neuronen.
Corticogenese (Experiment C):
• Satb2 → lagen II–IV (post-mitotisch; upper layers).
• Cux1 → lagen II–IV.
• Ctip2 → lagen V.
• Tbr1 → laag VI.
• Tbr2 → SVZ (intermediaire progenitorcellen).
• NF → axonen.
2
