Primaire Artikel 1: Role of Aberrant Spontaneous Neurotransmission in SNAP25-Associated Encephalopathies – Alten et
al., 2021
Centrale vraag:
• Hoe veroorzaken verschillende mutaties in het synaptische fusie-eiwit SNAP25 de
uiteenlopende synaptische verstoringen die leiden tot de klinische variatie in ontwikkelings- en
epileptische encefalopathieën (DEEs)?
• Welke synaptische mechanismen (evoked release, spontaneous release, SNARE-stabiliteit)
verklaren waarom SNAP25-mutaties zulke verschillende neurologische ziektebeelden geven?
Belangrijkste bevindingen:
• SNAP25-mutaties veroorzaken variant-specifieke synaptische verstoringen:
o Hoewel alle mutaties in hetzelfde eiwit zitten, leidt elke mutatie tot een uniek patroon van
verstoringen in evoked release, spontaneous release, RRP-grootte en netwerkactiviteit
→ verklaring van klinische heterogeniteit in DEEs.
• Structurele positie van de mutatie bepaalt het functionele synaptische fenotype:
o Mutaties die clusteren in dezelfde regio van de SNARE-helix (bijv. N-terminaal, C-terminaal, Syt1-interface) veroorzaken vergelijkbare
synaptische defecten → structure–function relatie is zeer sterk.
• Haplo-insufficiëntie verklaart de ziekte niet:
o Het verlies van één allel geeft slechts milde synaptische effecten → pathologie komt vooral door dominant-negatieve of dominant-
positieve effecten van de mutante eiwitten.
• Verstoorde spontane neurotransmitterafgifte is een sleutelmechanisme:
o Sommige mutaties verhogen spontane release extreem (tot 40×), en één mutatie (L50S) doet dit zonder evoked release te verstoren
→ spontane release kan op zichzelf ziekte veroorzaken.
Introductie:
Wat zijn DEEs?
• Developmental and epileptic encephalopathies (DEEs) = ernstige, heterogene neurologische aandoeningen bij kinderen.
• Gekenmerkt door:
o Epilepsie die moeilijk te behandelen is.
o Ontwikkelingsvertraging door: epileptische activiteit zelf, onderliggende genetische oorzaak, of beide.
Genetische oorzaak: synaptische transmissie
• Dankzij next-generation sequencing zijn veel de novo mutaties gevonden in genen die synaptische transmissie reguleren.
• Vooral mutaties in componenten van het SNARE-fusiecomplex:
o Synaptobrevin-2 (VAMP2)
o Syntaxin-1
o Synaptotagmin-1 (Ca²⁺-sensor)
o SNAP25 → meeste mutaties gevonden bij DEE-patiënten.
Rol van het SNARE-complex:
• Essentieel voor evoked neurotransmitter release:
o Actiepotentiaal → depolarisatie → Ca²⁺ influx → vesikelfusie.
• SNARE-complex bestaat uit:
o Synaptobrevin-2 (vesikel)
o Syntaxin-1 (membraan)
o SNAP25 (2 helixmotieven)
• Vormt een vier-helix bundel die de vesikel naar de membraan trekt en fusie aandrijft.
Waarom SNAP25 centraal staat:
• SNAP25 heeft de meeste ziekteveroorzakende mutaties binnen het SNARE-complex.
• Mutaties liggen verspreid door het hele eiwit → ideaal model om te begrijpen:
o hoe verstoringen in fusie leiden tot DEE,
o waarom klinische symptomen zo variëren.
1
,Bekende SNAP25-mutaties:
• Tot nu toe 10 heterozygote mutaties beschreven.
• Bijna allemaal de novo, behalve R59P (geërfd van asymptomatische mozaïekvader).
• Mutaties komen voor in twee isoformen:
o SNAP25a → embryonale/ vroege postnatale fase
o SNAP25b → volwassen isoform
• R59P en I67N zitten alleen in SNAP25b.
Klinische variatie:
• Grote variatie in:
o type epilepsie
o ernst van ontwikkelingsachterstand
o respons op medicatie
o bijkomende symptomen (ataxie, dysmorfieën)
• Voorbeelden:
o R59P → mild fenotype
o Q174X, I192N → lethaal in eerste levensjaar
Open vraag die het artikel wil beantwoorden:
• Zijn deze aandoeningen het gevolg van:
o simpel verlies van SNAP25-functie,
o of specifieke synaptische verstoringen door mutante SNAP25 die het wildtype eiwit dominant-negatief beïnvloeden?
Effecten van SNAP25-haplo-insufficiëntie op synaptische transmissie
Waarom dit experiment?
• Centrale vraag: Omdat alle patiënten met SNAP25-mutaties slechts één functioneel allel hebben, wilden de auteurs eerst weten: Is
haplo-insufficiëntie van SNAP25 op zichzelf voldoende om synaptische transmissie te verstoren en DEE-achtige fenotypes te veroorzaken?
• Waarom belangrijk?
o SNAP25 is essentieel voor vesikelfusie.
o SNAP25-/- is lethaal → dus zelfs kleine reducties kunnen belangrijk zijn.
o Als haplo-insufficiëntie wel grote synaptische defecten zou geven, dan zouden de mutaties misschien gewoon “loss-of-function” zijn.
o Als haplo-insufficiëntie geen grote defecten geeft, dan moeten de mutaties specifieke, variant-afhankelijke synaptische
verstoringen veroorzaken.
Figuur 1A: Experimentele opzet
• Deelvraag:
o Hoe meten we synaptische transmissie in SNAP25+/- muizen?
• Proefopzet:
o Acute hippocampale slices (CA1-gebied).
o Stimulatie van Schaffer collaterals (axonen van CA3 → CA1).
o Meting van fEPSPs (field excitatory postsynaptic potentials).
o Vergelijking tussen WT en SNAP25+/- (Het).
o fEPSPs meten de gezamenlijke activiteit van veel synapsen tegelijk, dus dit geeft een globaal beeld van synaptische functie.
• Wat laat dit paneel zien?
o De anatomische en elektrofysiologische opzet is identiek voor beide groepen.
o Dit bevestigt dat verschillen in latere panelen niet door technische variatie komen.
• Interpretatie:
o De experimentele basis is solide → eerlijke vergelijking tussen WT en Het.
2
, Figuur 1B: Evoked synaptic transmission (input-output curve)
• Deelvraag:
o Is de efficiëntie van evoked neurotransmitterafgifte verminderd bij haplo-insufficiëntie?
• Proefopzet:
o Stimulatie-intensiteit geleidelijk verhogen.
o Meten hoe sterk de postsynaptische fEPSP wordt.
o Normaal: hogere stimulatie → grotere fEPSP.
o Normale input-output curve betekent dat zowel aantal functionele synapsen als de postsynaptische gevoeligheid niet veranderd zijn.
• Resultaten:
o WT en Het tonen bijna identieke curves.
o Geen verschuiving in gevoeligheid of maximale respons.
• Interpretatie:
o Evoked release is volledig normaal bij SNAP25+/-.
o Dus 50% SNAP25 is voldoende voor normale actiepotentiaal-gedreven transmissie.
Figuur 1C: Paired-pulse ratio (PPR):
• Deelvraag:
o Is de release probability (kans dat een vesikel fuseert bij een actiepotentiaal) veranderd?
• Proefopzet:
o Twee stimuli snel achter elkaar geven (bijv. 50 ms interval).
o PPR is een zuiver presynaptische maat, dus veranderingen hierin zeggen niets over postsynaptische
receptoren.
o PPR = amplitude2 / amplitude1.
o Hoge PPR (boven 1.0) → lage release probability (facilitatie).
o Lage PPR (onder 1.0) → hoge release probability (depressie).
• Resultaten:
o SNAP25+/-= heeft licht verhoogde PPR.
o Dit wijst op iets lagere release probability.
• Interpretatie:
o Er is een milde presynaptische verandering, maar functioneel zeer beperkt.
o Niet genoeg om epilepsie of ernstige ontwikkelingsstoornissen te verklaren.
Figuur 1D-E: Spontaneous miniature release (mEPSCs/mIPSCs)
• Deelvraag:
o Is spontane vesikelfusie (actiepotentiaal-onafhankelijk) verstoord?
• Proefopzet:
o TTX toevoegen → blokkeert actiepotentialen.
o Miniature postsynaptic currents meten (frequentie = fusieratio, amplitude = postsynaptische receptorrespons).
o Frequentie weerspiegelt aantal functionele release-sites; amplitude weerspiegelt postsynaptische receptorfunctie (AMPA bij mEPSCs).
• Resultaten:
o Frequentie: geen verschil tussen WT en Het.
o Amplitude: geen verschil tussen WT en Het.
• Interpretatie:
o Basale vesikelfusie en postsynaptische receptorfunctie zijn volledig normaal.
o Geen aanwijzing voor verstoring van spontane neurotransmissie.
o Normale mEPSCs tonen aan dat zowel presynaptische vesikelinhoud als postsynaptische receptorrespons intact zijn.
Samengevoegde conclusie van alle figuurpanelen:
• Evoked synaptic transmission is normaal bij SNAP25+/-.
• Spontane neurotransmitterafgifte is normaal.
• Release probability is slechts minimaal verlaagd.
• Geen structurele of functionele synaptische degradatie zichtbaar.
• Haplo-insufficiëntie veroorzaakt dus alleen subtiele presynaptische veranderingen.
3
al., 2021
Centrale vraag:
• Hoe veroorzaken verschillende mutaties in het synaptische fusie-eiwit SNAP25 de
uiteenlopende synaptische verstoringen die leiden tot de klinische variatie in ontwikkelings- en
epileptische encefalopathieën (DEEs)?
• Welke synaptische mechanismen (evoked release, spontaneous release, SNARE-stabiliteit)
verklaren waarom SNAP25-mutaties zulke verschillende neurologische ziektebeelden geven?
Belangrijkste bevindingen:
• SNAP25-mutaties veroorzaken variant-specifieke synaptische verstoringen:
o Hoewel alle mutaties in hetzelfde eiwit zitten, leidt elke mutatie tot een uniek patroon van
verstoringen in evoked release, spontaneous release, RRP-grootte en netwerkactiviteit
→ verklaring van klinische heterogeniteit in DEEs.
• Structurele positie van de mutatie bepaalt het functionele synaptische fenotype:
o Mutaties die clusteren in dezelfde regio van de SNARE-helix (bijv. N-terminaal, C-terminaal, Syt1-interface) veroorzaken vergelijkbare
synaptische defecten → structure–function relatie is zeer sterk.
• Haplo-insufficiëntie verklaart de ziekte niet:
o Het verlies van één allel geeft slechts milde synaptische effecten → pathologie komt vooral door dominant-negatieve of dominant-
positieve effecten van de mutante eiwitten.
• Verstoorde spontane neurotransmitterafgifte is een sleutelmechanisme:
o Sommige mutaties verhogen spontane release extreem (tot 40×), en één mutatie (L50S) doet dit zonder evoked release te verstoren
→ spontane release kan op zichzelf ziekte veroorzaken.
Introductie:
Wat zijn DEEs?
• Developmental and epileptic encephalopathies (DEEs) = ernstige, heterogene neurologische aandoeningen bij kinderen.
• Gekenmerkt door:
o Epilepsie die moeilijk te behandelen is.
o Ontwikkelingsvertraging door: epileptische activiteit zelf, onderliggende genetische oorzaak, of beide.
Genetische oorzaak: synaptische transmissie
• Dankzij next-generation sequencing zijn veel de novo mutaties gevonden in genen die synaptische transmissie reguleren.
• Vooral mutaties in componenten van het SNARE-fusiecomplex:
o Synaptobrevin-2 (VAMP2)
o Syntaxin-1
o Synaptotagmin-1 (Ca²⁺-sensor)
o SNAP25 → meeste mutaties gevonden bij DEE-patiënten.
Rol van het SNARE-complex:
• Essentieel voor evoked neurotransmitter release:
o Actiepotentiaal → depolarisatie → Ca²⁺ influx → vesikelfusie.
• SNARE-complex bestaat uit:
o Synaptobrevin-2 (vesikel)
o Syntaxin-1 (membraan)
o SNAP25 (2 helixmotieven)
• Vormt een vier-helix bundel die de vesikel naar de membraan trekt en fusie aandrijft.
Waarom SNAP25 centraal staat:
• SNAP25 heeft de meeste ziekteveroorzakende mutaties binnen het SNARE-complex.
• Mutaties liggen verspreid door het hele eiwit → ideaal model om te begrijpen:
o hoe verstoringen in fusie leiden tot DEE,
o waarom klinische symptomen zo variëren.
1
,Bekende SNAP25-mutaties:
• Tot nu toe 10 heterozygote mutaties beschreven.
• Bijna allemaal de novo, behalve R59P (geërfd van asymptomatische mozaïekvader).
• Mutaties komen voor in twee isoformen:
o SNAP25a → embryonale/ vroege postnatale fase
o SNAP25b → volwassen isoform
• R59P en I67N zitten alleen in SNAP25b.
Klinische variatie:
• Grote variatie in:
o type epilepsie
o ernst van ontwikkelingsachterstand
o respons op medicatie
o bijkomende symptomen (ataxie, dysmorfieën)
• Voorbeelden:
o R59P → mild fenotype
o Q174X, I192N → lethaal in eerste levensjaar
Open vraag die het artikel wil beantwoorden:
• Zijn deze aandoeningen het gevolg van:
o simpel verlies van SNAP25-functie,
o of specifieke synaptische verstoringen door mutante SNAP25 die het wildtype eiwit dominant-negatief beïnvloeden?
Effecten van SNAP25-haplo-insufficiëntie op synaptische transmissie
Waarom dit experiment?
• Centrale vraag: Omdat alle patiënten met SNAP25-mutaties slechts één functioneel allel hebben, wilden de auteurs eerst weten: Is
haplo-insufficiëntie van SNAP25 op zichzelf voldoende om synaptische transmissie te verstoren en DEE-achtige fenotypes te veroorzaken?
• Waarom belangrijk?
o SNAP25 is essentieel voor vesikelfusie.
o SNAP25-/- is lethaal → dus zelfs kleine reducties kunnen belangrijk zijn.
o Als haplo-insufficiëntie wel grote synaptische defecten zou geven, dan zouden de mutaties misschien gewoon “loss-of-function” zijn.
o Als haplo-insufficiëntie geen grote defecten geeft, dan moeten de mutaties specifieke, variant-afhankelijke synaptische
verstoringen veroorzaken.
Figuur 1A: Experimentele opzet
• Deelvraag:
o Hoe meten we synaptische transmissie in SNAP25+/- muizen?
• Proefopzet:
o Acute hippocampale slices (CA1-gebied).
o Stimulatie van Schaffer collaterals (axonen van CA3 → CA1).
o Meting van fEPSPs (field excitatory postsynaptic potentials).
o Vergelijking tussen WT en SNAP25+/- (Het).
o fEPSPs meten de gezamenlijke activiteit van veel synapsen tegelijk, dus dit geeft een globaal beeld van synaptische functie.
• Wat laat dit paneel zien?
o De anatomische en elektrofysiologische opzet is identiek voor beide groepen.
o Dit bevestigt dat verschillen in latere panelen niet door technische variatie komen.
• Interpretatie:
o De experimentele basis is solide → eerlijke vergelijking tussen WT en Het.
2
, Figuur 1B: Evoked synaptic transmission (input-output curve)
• Deelvraag:
o Is de efficiëntie van evoked neurotransmitterafgifte verminderd bij haplo-insufficiëntie?
• Proefopzet:
o Stimulatie-intensiteit geleidelijk verhogen.
o Meten hoe sterk de postsynaptische fEPSP wordt.
o Normaal: hogere stimulatie → grotere fEPSP.
o Normale input-output curve betekent dat zowel aantal functionele synapsen als de postsynaptische gevoeligheid niet veranderd zijn.
• Resultaten:
o WT en Het tonen bijna identieke curves.
o Geen verschuiving in gevoeligheid of maximale respons.
• Interpretatie:
o Evoked release is volledig normaal bij SNAP25+/-.
o Dus 50% SNAP25 is voldoende voor normale actiepotentiaal-gedreven transmissie.
Figuur 1C: Paired-pulse ratio (PPR):
• Deelvraag:
o Is de release probability (kans dat een vesikel fuseert bij een actiepotentiaal) veranderd?
• Proefopzet:
o Twee stimuli snel achter elkaar geven (bijv. 50 ms interval).
o PPR is een zuiver presynaptische maat, dus veranderingen hierin zeggen niets over postsynaptische
receptoren.
o PPR = amplitude2 / amplitude1.
o Hoge PPR (boven 1.0) → lage release probability (facilitatie).
o Lage PPR (onder 1.0) → hoge release probability (depressie).
• Resultaten:
o SNAP25+/-= heeft licht verhoogde PPR.
o Dit wijst op iets lagere release probability.
• Interpretatie:
o Er is een milde presynaptische verandering, maar functioneel zeer beperkt.
o Niet genoeg om epilepsie of ernstige ontwikkelingsstoornissen te verklaren.
Figuur 1D-E: Spontaneous miniature release (mEPSCs/mIPSCs)
• Deelvraag:
o Is spontane vesikelfusie (actiepotentiaal-onafhankelijk) verstoord?
• Proefopzet:
o TTX toevoegen → blokkeert actiepotentialen.
o Miniature postsynaptic currents meten (frequentie = fusieratio, amplitude = postsynaptische receptorrespons).
o Frequentie weerspiegelt aantal functionele release-sites; amplitude weerspiegelt postsynaptische receptorfunctie (AMPA bij mEPSCs).
• Resultaten:
o Frequentie: geen verschil tussen WT en Het.
o Amplitude: geen verschil tussen WT en Het.
• Interpretatie:
o Basale vesikelfusie en postsynaptische receptorfunctie zijn volledig normaal.
o Geen aanwijzing voor verstoring van spontane neurotransmissie.
o Normale mEPSCs tonen aan dat zowel presynaptische vesikelinhoud als postsynaptische receptorrespons intact zijn.
Samengevoegde conclusie van alle figuurpanelen:
• Evoked synaptic transmission is normaal bij SNAP25+/-.
• Spontane neurotransmitterafgifte is normaal.
• Release probability is slechts minimaal verlaagd.
• Geen structurele of functionele synaptische degradatie zichtbaar.
• Haplo-insufficiëntie veroorzaakt dus alleen subtiele presynaptische veranderingen.
3
