Samenvatting methoden in het biomedisch onderzoek 14/20! (E0F93A)

METHODEN
H1: INHOUD
 Inleiding: belang van methoden, doelstelling van de cursus, inpassing in de leerlijnen, organisatie,
inhoud, examens
 Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
 Studiemateriaal en staalbereiding: humaan organisme, modelsystemen (weefsel, xenograften,
weefselcultuur, celculturen,, modelorganismen), staalbereiding (staalname, (micro)-dissectie en
fractionatie, cel sortering, bewaring en biobanking)
 Basisprincipes van bio-veiligheid: wanneer en waarom dragen we een labo-jas, veiligheidsbril,
handschoenen,…? Klassen van bio-veiligheid; basis van afvalproblematiek.
 Meten en schatten: eenheden en omzetten van eenheden; nauwkeurigheid en meetfouten;
systematische fouten; random fouten; absolute en relatieve fouten; beduidende cijfers; schatten van
grootteorders. Basis van excel (gemiddelde, mediaan,…)
 Elementaire basistechnieken: pipeteren; verdunningen, buffers en fysiologische oplossingen; meten
van de osmolariteit; pH-bepaling; sedimentatie en centrifuge
 Licht- en fluorescentiemicroscoop: fysica van licht en golven, basisprincipes van optica, principe van
de lichtmicroscoop en fluorescentemicroscoop.
 Luminescentie, fluorescentie: principe, toepassingen in biomedisch onderzoek
 Spectroscopie: infraroodspectroscopie, NMR-spectroscopie, massaspectrometrie, UV-zichtbaar licht-
spectroscopie
 Chromatografie: gaschromatografie, vloeistofchromatografie, HPCL,…
 Elektroforese, western blot: principe, toepassingen in biomedisch onderzoek
 Celbiologische methoden: celproliferatie, celdood, migratie, invasiteit, tissue engineering,…
 Analyse van DNA: isoleren, in vitro aanmaken van DNA, concentreren, kwantificeren, manipuleren,
DNA-sequentiebepaling


H2: BIOMEDISCHE VRAAGSTELLING EN ONDERZOEKSMETHODIEK

HET DOMEIN VAN HET BIOMEDISCH ONDERZOEK IS ZEER BREED
Disciplines
 Fysiologie: hoe werkt ons lichaam?
 neurowetenschappen, cardiologie, hematologie, endocrinologie,…
 Pathologie: wat loopt er fout?
 neurodegeneratieve aandoeningen, hart- en vaatziekten, kanker, diabetes, infectieziekten,…


ER IS EEN ZEER BREED GAMMA AAN VRAAGSTELLINGEN
Open exploratief  hypothese-gedreven
 Open exploratief onderzoek:
= onderzoek waarbij we breed gaan zoeken naar een antwoord zonder een specifieke richting te
kiezen. Vb. Hoe beïnvloeden androgenen het ontstaan en de progressie van prostaatkanker?
 onderzoeken welke genen/eiwitten worden geregeld door androgenen in prostaatkankercellen

 Hypothese-gedreven onderzoek:
= onderzoek waarbij we een antwoord vooropstellen (hypothese) en dit toetsen
Vb. Wordt prostaatkanker beïnvloed door androgenen via modulatie van het Ets gen?


1

,  de hypothese is dat Ets hierin een rol speelt deze hypothese kan experimenteel getest worden
Fundamenteel / translationeel / klinisch
 Fundamenteel
= gericht op een gedetailleerde analyse van de moleculaire bestanddelen en processen in de cel en in
het organisme
 Translationeel
= maakt de overgang tussen fundamenteel en klinisch onderzoek
 Klinisch
= patiëntgericht
 optimaliseren van diagnose
 verbetering van behandeling
 nieuw geneesmiddel
PICO principe van ‘evidence-based medicine’
(Patient – Intervention – Controls – Outcome)
Fasen 1 – 4
Analyses in vivo / ex vivo / in vitro / in silico
 In vivo: bepalingen bij levende organismen (bv. lichaamstemperatuur, bloeddruk,… meten)
 Ex vivo: metingen op stalen van een organisme (bv. immuunhistochemie van biopt,…)
 In vitro: metingen in de proefbuis (bv. bepaling van DNA concentratie, PCR reactie,…)
 In silico: analyses met een computer (bv. (re)analyse genexpressiedata,…)


ONTWERP VAN BIOMEDISCHE EXPERIMENTEN


Probleem


Literatuurstudie


onderzoeksvraag /hypothese


biologisch systeem / modelsysteem


bepaling van de variabele (wat meten?)


keuze van methode (hoe?)


uitvoering experiment


herhaling experiment


analyse van de experimenten + statististische testen


formulering van conclusie



2

,TWEE GROTE KLASSEN VAN METHODEN

Methoden voor analyse Methoden voor modulatie
We meten iets We veranderen iets aan het organisme/proefmodel
Voorbeelden: Voorbeelden:
- Klinische analyse (hormonen, metabolieten,…) - Behandeling met inhibitor
- Isolatie, meting, sequentiebepaling van DNA,… - Transfectie met plasmidencectoren
- Analyse van processen (gentranscriptie) - Transgenese
- RNA interferentie


STATISCHE BEPALINGEN VERSUS KWANTITATIEVE, DYNAMISCHE EN VERGELIJKENDE ANALYSE

Statische bepalingen Kwantitatieve, dynamische & vergelijkende analyse
We bepalen iets dat relatief onveranderlijk is of dat We bepalen iets dat makkelijk varieert en een range
discrete waarden (identificatie) geeft van waarden kan hebben
Voorbeelden: Voorbeelden:
- Bepaling van gensequentie - Meting van cholesterolspiegels
- Bepaling van intron-exon boundaries - Meting van suikerspiegels voor en na maaltijd
- Identificatie van interagerende eiwitten - vgl transcriptoom van gezond versus ziek weefsel


VEREISTEN / EIGENSCHAPPEN VAN METHODEN
 Precisie = variabiliteit: maat voor reproduceerbaarheid  standaard deviatie, coëfficiënt van variatie
 Accuraatheid: verschil tussen gemeten waarde en de “echte” waarde  populatiestatistiek
(confidentieniveau / confidentie-interval)
 Detectielimiet = gevoeligheid: kleinste waarde die met een bepaalde gekozen zekerheid kan gemeten
worden
 Analytische range / dynamic range: gebied dat reproduceerbare gegevens geeft
 Analytische specificiteit = selectiviteit: mate waardoor andere componenten in het systeem
interfereren
 Analytische sensitiviteit: maat van verandering in output tov. de verandering in input
 Robuustheid: mate waarin de methode een consistent resultaat geeft ondanks kleine verschillen in
experimentele parameters (bv. pH)


SELECTIE VAN METHODE
Criteria:
 Te meten variabele (bv DNA concentratie, DNA sequentie, eiwitfosforylatie,…)
 Vereiste precisie, detectielimiet (bv hoge versus lage DNA concentraties)
 Aantal stalen / waarden (bv DNA sequentie van 1 PCR product of van het hele genoom)
 Beschikbaarheid apparatuur (bv heb ik een fluorimeter voor DNA bepaling of een colorimeter)
 Kosten (wat kan ik besteden per assay?)
 Veiligheidsrisico’s (mag ik werken met radioactiviteit, virussen?)
 Vroegere / gepubliceerde ervaringen
 Persoonlijke voorkeur




3

, H3: STUDIEMATERIAAL

HUMAAN ORGANISME
 Studies op organisme zelf
Vb. klinische test, beeldvorming
 Fysiologische vloeistoffen (liquid biopsies):
Urine, speeksel, bloed (inclusief cellen), cerebrospinaal vocht (ruggenmergpunctie)
 Weefselbiotopen
Chirurgisch weefsel, naaldbiopten
 Voordelen: meest direct relevant voor geneeskunde
 Mogelijkheden: vgl. gezond versus ziek, voor en na behandeling, individuen onderling, meting van
parameters in functie van leeftijd of uur van de dag,…
 Nadelen: beperkte mogelijkheden voor testing en modulatie

Types studies
 Interventionele / niet-interventionele studie
 Patiënten / vrijwilligers
 Prospectieve / retrospectieve studie
 Cross-sectionele / longitudinale studie

Aandachtspunten bij studie-ontwerp
 Algemeen principe: maximale voordelen, minimale risico’s
 Gezondheid en veiligheid van deelnemers
 Databeheer
– EU General Data Protection Regulation (GDPR)
– Persoonlijke Informatie (persoonlijke, medische, genetische, …)
– Versleuteling stalen en gegevens
– Bewaring, toegang, beveiliging, delen
 Geïnformeerde toestemming en ethische goedkeuring

Ethische goedkeuring bij onderzoek met mensen of menselijk materiaal
 Vrijwillige en geïnformeerde toestemming
– Vrijwillige deelname, deelname kunnen weigeren of stopzetten zonder consequenties
– Begrijpbaar informatieformulier
– Informeren over doel, methode, procedure, voordelen, risico’s, recht op stopzetting
deelname
– Schriftelijke, ondertekende informed consent
– Speciale voorzorgen bij kinderen of kwetsbare groepen
 Goedkeuring Clinical Trial Center en Ethische Commissie UZ Leuven/KU Leuven
– http://www.uzleuven.be/ec/
– Maakt deel uit van arts-patiënt relatie
– Hoofdonderzoeker Good Clinical Practice certificaat
 Declaration of Helsinki
 EU en nationale wetgeving




4