1 Analysemethoden voor nucleïnezuren
1.1 Inleiding
- Menselijk Genoomproject: 1990 – 2003 (> 10 jaar om genoom te sequensen)
- Vorderingen erfelijkheidsonderzoek:
▪ Eenvoudige stamboomanalyses → minuscule structuurveranderingen in chromosomen zicht-
baar maken
▪ Voor veel ziekten: verantwoordelijke gen en welke fout in gen
- Nieuwe behandelingen:
▪ Productie recombinante eiwitten (= eiwit dat men aangemaakt heeft door de code van het EW
in te brengen in m.o. of zoogdiercellen) voor therapie
▪ Gen- en stamceltherapie
- Diagnosetechnieken:
▪ Cytogenetische onderzoeksmethoden → uitzicht chomosomen
▪ Moleculaire onderzoeksmethoden → structuur aparte DNA-moleculen
1.1.1 Cytogenetische onderzoeksmethoden
1.1.1.1 Karyotypering
- Vertrek uit perifere bloedmonocyten (PBMC)
- Ook soms uit beenmerg, gekweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of chorion (één van
de membranen tussen foetus en moeder) villi
- Toevoegen fytohemagglutinine → stimulatie T-lymfocyten → mitose
- Na 48 – 72 uur: toevoeging colchicine (interfereert met de vorming van spoeldraden)→ stopt
celdeling in de metafase (chromos. net zichtbaar)
- Toevoegen hypotone oplossing → water opnemen → opzwellen → individuele chromos. scheiden
- Fixeren
- Op microscoopglaasje + drogen
1.1.1.2 G-banding
Gebruik van Giemsa-kleuring → G-banding: alternerende lichte en donkere bandjes, karakteristiek
voor ieder chromosomenpaar:
- Donkere bandjes: weinig genen, zijn
AT-rijk en repliceren laat in S-fase
- Lichte bandjes: 80% actieve genen
(huishoud-genen), GC-rijk en repliceren
vroeg in S-fase
- Precieze identificatie elk chromosoom
en ontbreken of bijkomen DNA-
materiaal tot 4000 kb
- Betere resolutie = FISH (fluorescence in situ hybridization), FCM of analyse DNA met aCGH (array
comparative genomic hybridision)
Alternatief: Quinacrine-kleuring → Q-banding
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 1
,1.1.1.3 Flow karyotypering
- Modernere techniek met betere resolutie
- Gebruikt om variatie in chromos. na te gaan en identificatie chromosoomafwijkingen
- Resolutie = 1 – 2 Mb t.o.v. 4 Mb voor lichtmicroscopische karyotypering
Resultaat:
- Flow karyotypes man en vrouw, elke piek =
individueel chromosomenpaar van groepen
chromosomen
- DNA-inhoud individuele chromosomen meten
m.b.v. FCM → vloeistofstroom door laser
- Chromosoomsuspensie kleuren: ethidium
bromide = fluorescerende kleurstof
- Meting: fotomultiplier
- Analyse: m.b.v. computer
- Resultaat:
▪ Histogram/ flow karyotype → chromos.
groeperen volgens stijgende DNA-inhoud
▪ Relatieve DNA-inhoud = gem. piek
▪ Relatief # chromos. in elke groep =
oppervlak onder piek (normaal 2)
▪ X-chromos. bij vrouw 2x groter dan bij man
1.1.2 Moleculaire onderzoeksmethoden
= bestuderen nucleïnezuren
Hoe?
- DNA- en RNA-isolatie
- DNA-detectie:
▪ Elektroforese
▪ Hybridisatie
• DNA probes
• Detectie van labels
• Stappen in het hybridisatieproces
• Hybridisatiemethoden
- DNA profielen
- Array-based Comparative Genome Hybridisation (aCGH)
- PCR en afgeleide technieken
- DNA sequentiebepaling: de ultieme diagnostische tool → 3FBT
1.2 DNA- en RNA-isolatie
- mRNA’s isoleren: poly(A)-staart aan 3’ eind
- Isolatie via poly(T)oligonucleotide te koppelen op magnetische beads
- Rnase vrij werken (bakken glasmateriaal, handschoenen dragen) en gebruik Rnase-remmers
- DNA: denaturatie en extractie
- Detectie:
▪ UV-absorptie DNA en RNA bij 260 nm
▪ UV-absorptie eiwitten bij 280 nm
▪ OD-ratio? 260 nm/ 280 nm → zuiverheid staal (DNA isoleren uit bloedstaal met EW)
▪ Intercalerende kleurstoffen (nestelen zich tussen baseparen): fluorescerende DNA en RNA
kleurstoffen → EtBr of SYBR Green
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 2
,1.2.1 DNA isolatie
- Via denaturatie en extractie
- Gebruik van zouten om eiwitten te denatureren en hoogmoleculaire NZ in oplossing
te houden
- Isoleren: absorptie op silicadeeltjes (kolommen) of filtratie over semi-permeabele
membraan waaraan DNA blijft plakken = DNA-vlok
1.2.2 mRNA isolatie
→ magnetische bolletjes met een T-staart
→ mRNA kan binden door hun A-staart
1.3 DNA-detectie
1.3.1 Gel-elektroforese
- Gebruik van agarose matrices (of polyacrylamide)
- DNA- en RNA moleculen d.m.v. hoog oplossend
vermogen scheiden
- Door negatief geladen fosfaatgroepen → nucleïne-
zuren bewegen zich bij pH 7 à 8 naar + pool
- Migratiesnelheid is afhankelijk van: type gelmatrix,
poriëngrootte, moleculaire afmetingen NZ en
conformatie NZ
Procedure:
Houder afplakken → “kammetje” plaatsen met slotjes → DNA staal laden → agarose in buffer brengen
→ opwarmen in microgolfoven → afkoelen tot 55°C → uitgieten → agarose gaat stollen = geleren →
einde elektroforese → op UV-transeleminator bekijken (tegenwoordig in geïntegreerd systeem)
1.3.1.1 Intercalerende stoffen
Ethidiumbromide
- Licht op bij UV licht
- Uiterst mutageen → vermijden → nu gebruik SYBR Safe!
- Werking: kruipt tussen baseparen → gebruik UV licht → DNA moleculen zichtbaar
SYBR Green = SYBR Safe
- Excitatie: max = 497 nm
- Emissie: max = 520 nm → licht uitzenden
- Minder mutageen dan EtBr, maar cytotoxisch → penetreert cellen
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 3
, 1.3.1.2 DNA gelelektoforese
Negatieve pool
Groot
Klein
Positieve pool
Legende:
- Links = lengtemerken van DNA-fragmenten met gekende grootte
- Midden = DNA geknipt mey drie verschillende restrictie enzymen
- Rechts = controle DNA, niet geknipt
1.3.1.3 RNA gelelektroforese
Negatieve pool
Positieve pool
Moeilijker, uit één celtype al het mRNA of totaal RNA isoleren → alle fragmenten verschillende lengte
→ nooit genoeg RNA-moleculen van zelfde lengte om zichtbaar te zijn op gel (bepaalde detectielimiet)
Wat is wel te zien:
- 28S rRNA (intenisteit 2x zo groot als de intensiteit van 18S rRNA)
- 18S rRNA
Legende:
- Laan 1 en 2: intacte RNA-stalen met 28S:18S rRNA ratio = 2:1
- Laan 3: gedegradeerd RNA met RNA smeer onder 28S en 18S rRNA bandjes
- Laan 4: gedegradeerd RNA → verlies 28S rRNA band en opstapeling gedegradeerd RNA onderaan
- Laan 5: RNA met aanzienlijke genomische DNA contaminatie
1.3.1.4 Polyacrylamide gelelektroforese
- Voor scheiden van DNA
- resolutie of oplossend vermogen → mogelijkheid om zeer kleine verschillen in lengte van elkaar
te onderscheiden (1 tot enkele nucleotiden)
- Handig voor zeer korte fragmenten
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 4
1.1 Inleiding
- Menselijk Genoomproject: 1990 – 2003 (> 10 jaar om genoom te sequensen)
- Vorderingen erfelijkheidsonderzoek:
▪ Eenvoudige stamboomanalyses → minuscule structuurveranderingen in chromosomen zicht-
baar maken
▪ Voor veel ziekten: verantwoordelijke gen en welke fout in gen
- Nieuwe behandelingen:
▪ Productie recombinante eiwitten (= eiwit dat men aangemaakt heeft door de code van het EW
in te brengen in m.o. of zoogdiercellen) voor therapie
▪ Gen- en stamceltherapie
- Diagnosetechnieken:
▪ Cytogenetische onderzoeksmethoden → uitzicht chomosomen
▪ Moleculaire onderzoeksmethoden → structuur aparte DNA-moleculen
1.1.1 Cytogenetische onderzoeksmethoden
1.1.1.1 Karyotypering
- Vertrek uit perifere bloedmonocyten (PBMC)
- Ook soms uit beenmerg, gekweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of chorion (één van
de membranen tussen foetus en moeder) villi
- Toevoegen fytohemagglutinine → stimulatie T-lymfocyten → mitose
- Na 48 – 72 uur: toevoeging colchicine (interfereert met de vorming van spoeldraden)→ stopt
celdeling in de metafase (chromos. net zichtbaar)
- Toevoegen hypotone oplossing → water opnemen → opzwellen → individuele chromos. scheiden
- Fixeren
- Op microscoopglaasje + drogen
1.1.1.2 G-banding
Gebruik van Giemsa-kleuring → G-banding: alternerende lichte en donkere bandjes, karakteristiek
voor ieder chromosomenpaar:
- Donkere bandjes: weinig genen, zijn
AT-rijk en repliceren laat in S-fase
- Lichte bandjes: 80% actieve genen
(huishoud-genen), GC-rijk en repliceren
vroeg in S-fase
- Precieze identificatie elk chromosoom
en ontbreken of bijkomen DNA-
materiaal tot 4000 kb
- Betere resolutie = FISH (fluorescence in situ hybridization), FCM of analyse DNA met aCGH (array
comparative genomic hybridision)
Alternatief: Quinacrine-kleuring → Q-banding
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 1
,1.1.1.3 Flow karyotypering
- Modernere techniek met betere resolutie
- Gebruikt om variatie in chromos. na te gaan en identificatie chromosoomafwijkingen
- Resolutie = 1 – 2 Mb t.o.v. 4 Mb voor lichtmicroscopische karyotypering
Resultaat:
- Flow karyotypes man en vrouw, elke piek =
individueel chromosomenpaar van groepen
chromosomen
- DNA-inhoud individuele chromosomen meten
m.b.v. FCM → vloeistofstroom door laser
- Chromosoomsuspensie kleuren: ethidium
bromide = fluorescerende kleurstof
- Meting: fotomultiplier
- Analyse: m.b.v. computer
- Resultaat:
▪ Histogram/ flow karyotype → chromos.
groeperen volgens stijgende DNA-inhoud
▪ Relatieve DNA-inhoud = gem. piek
▪ Relatief # chromos. in elke groep =
oppervlak onder piek (normaal 2)
▪ X-chromos. bij vrouw 2x groter dan bij man
1.1.2 Moleculaire onderzoeksmethoden
= bestuderen nucleïnezuren
Hoe?
- DNA- en RNA-isolatie
- DNA-detectie:
▪ Elektroforese
▪ Hybridisatie
• DNA probes
• Detectie van labels
• Stappen in het hybridisatieproces
• Hybridisatiemethoden
- DNA profielen
- Array-based Comparative Genome Hybridisation (aCGH)
- PCR en afgeleide technieken
- DNA sequentiebepaling: de ultieme diagnostische tool → 3FBT
1.2 DNA- en RNA-isolatie
- mRNA’s isoleren: poly(A)-staart aan 3’ eind
- Isolatie via poly(T)oligonucleotide te koppelen op magnetische beads
- Rnase vrij werken (bakken glasmateriaal, handschoenen dragen) en gebruik Rnase-remmers
- DNA: denaturatie en extractie
- Detectie:
▪ UV-absorptie DNA en RNA bij 260 nm
▪ UV-absorptie eiwitten bij 280 nm
▪ OD-ratio? 260 nm/ 280 nm → zuiverheid staal (DNA isoleren uit bloedstaal met EW)
▪ Intercalerende kleurstoffen (nestelen zich tussen baseparen): fluorescerende DNA en RNA
kleurstoffen → EtBr of SYBR Green
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 2
,1.2.1 DNA isolatie
- Via denaturatie en extractie
- Gebruik van zouten om eiwitten te denatureren en hoogmoleculaire NZ in oplossing
te houden
- Isoleren: absorptie op silicadeeltjes (kolommen) of filtratie over semi-permeabele
membraan waaraan DNA blijft plakken = DNA-vlok
1.2.2 mRNA isolatie
→ magnetische bolletjes met een T-staart
→ mRNA kan binden door hun A-staart
1.3 DNA-detectie
1.3.1 Gel-elektroforese
- Gebruik van agarose matrices (of polyacrylamide)
- DNA- en RNA moleculen d.m.v. hoog oplossend
vermogen scheiden
- Door negatief geladen fosfaatgroepen → nucleïne-
zuren bewegen zich bij pH 7 à 8 naar + pool
- Migratiesnelheid is afhankelijk van: type gelmatrix,
poriëngrootte, moleculaire afmetingen NZ en
conformatie NZ
Procedure:
Houder afplakken → “kammetje” plaatsen met slotjes → DNA staal laden → agarose in buffer brengen
→ opwarmen in microgolfoven → afkoelen tot 55°C → uitgieten → agarose gaat stollen = geleren →
einde elektroforese → op UV-transeleminator bekijken (tegenwoordig in geïntegreerd systeem)
1.3.1.1 Intercalerende stoffen
Ethidiumbromide
- Licht op bij UV licht
- Uiterst mutageen → vermijden → nu gebruik SYBR Safe!
- Werking: kruipt tussen baseparen → gebruik UV licht → DNA moleculen zichtbaar
SYBR Green = SYBR Safe
- Excitatie: max = 497 nm
- Emissie: max = 520 nm → licht uitzenden
- Minder mutageen dan EtBr, maar cytotoxisch → penetreert cellen
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 3
, 1.3.1.2 DNA gelelektoforese
Negatieve pool
Groot
Klein
Positieve pool
Legende:
- Links = lengtemerken van DNA-fragmenten met gekende grootte
- Midden = DNA geknipt mey drie verschillende restrictie enzymen
- Rechts = controle DNA, niet geknipt
1.3.1.3 RNA gelelektroforese
Negatieve pool
Positieve pool
Moeilijker, uit één celtype al het mRNA of totaal RNA isoleren → alle fragmenten verschillende lengte
→ nooit genoeg RNA-moleculen van zelfde lengte om zichtbaar te zijn op gel (bepaalde detectielimiet)
Wat is wel te zien:
- 28S rRNA (intenisteit 2x zo groot als de intensiteit van 18S rRNA)
- 18S rRNA
Legende:
- Laan 1 en 2: intacte RNA-stalen met 28S:18S rRNA ratio = 2:1
- Laan 3: gedegradeerd RNA met RNA smeer onder 28S en 18S rRNA bandjes
- Laan 4: gedegradeerd RNA → verlies 28S rRNA band en opstapeling gedegradeerd RNA onderaan
- Laan 5: RNA met aanzienlijke genomische DNA contaminatie
1.3.1.4 Polyacrylamide gelelektroforese
- Voor scheiden van DNA
- resolutie of oplossend vermogen → mogelijkheid om zeer kleine verschillen in lengte van elkaar
te onderscheiden (1 tot enkele nucleotiden)
- Handig voor zeer korte fragmenten
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 4
