BIOTECHNOLOGIE EN GENETICA
1. INLEIDING
Het gebruik en manipulatie van biologische systemen ter (industriële) bereiding van
natuurlijke grondstoffen en biomassa (en door de mens gebruikt kunnen worden)
Biologische systemen: micro-organismen, plantaardige of dierlijke cellen, enzymen
geïsoleerd uit levende wezens.
NIET: traditionele agricultuur en veeteelt
Biologische systemen reeds duizenden jaren gebruikt.
- Tijdperk waarin op onbewuste wijze gebruik werd gemaakt van bacteriën en gisten
Ter productie van levensmiddelen als bier (fermentatie met gistcellen), wijn, kaas,
yoghurt en azijn
Eindigt 1850: L. Pasteur ontdekte dat micro-organismen de verantwoordelijken
zijn voor bepaalde omzettingen (productie van alcohol uit suikers, verzuring van wijn)
(Op die manier kon bewust gebruik worden gemaakt van biologische systemen, alhoewel de techniek om
contaminaties met vreemde micro-organismen uit te sluiten nog niet gekend was.)
Start TWEEDE periode:
- De introductie van industriële porcessen om grote hoeveelheden glycol, aceton en
citroenzuur aan te maken, massaproductie opgestart van bakkersgist.
- Al deze processen werden niet gehinderd door vreemde micro-organismen.
Start DERDE periode:
- Kennis van aseptische technieken (steriel werken, zodat we enkel het gewenste
bekomen)
Zuivere culturen
Farmaceutische productie van penicillines
Sindsdien werden de metabolieten van tal van micro-organismen beschreven en
geproduceerd
Start VIERDE periode:
- Invoer van recombinante DNA-technieken en de definitieve doorbraak van
plantaardige en dierlijke celculturen in productieprocessen (1970-1980)
Biotechnologie is veel meer dan enkel DNA-manipulaties, alhoewel beide begrippen vaak
verkeerdelijk als synoniem gebruikt worden.
De noodzaak aan massaproductie van oraal werkzame antimicrobiële stoffen leidde tot
de ontwikkeling van kiemverbetering en industriële aseptische technieken.
De invoer van recombinante DNA-technieken (begin ’80), ook genetic engineering
genoemd, betekende een ware doorbraak in de mogelijkheden van de farmaceutische
nijverheid.
DNA manipuleren (stabiele) wijzigingen al dan niet in het genoom van bepaalde cellen
Op industriële schaal recombinante proteïnen aanmaken
Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
⤷ Bepaalde neuro-endocriene boodschappers, lymfokines en bloedproteïnen wereldwijd
klinisch getest worden en therapeutisch gebruikt worden
⤷ Ook recombinante technieken voor: vaccins, mAb en enzymen
GGO = genetisch gemanipuleerde organismen
1
,Biologische GM moeten door EMA goedgekeurd worden
Vb. Insuline, wordt in ons lichaam geproduceerd synthetische humane insuline wordt
geproduceerd m.b.v. recombinant-DNA-technologie
⤷ Menselijk DNA, dat codeert voor menselijke insuline, wordt ingebracht in een E-coli
gastcel
Analyse van deze biogene producten = extreem belangrijk: kwaliteitscontrole!!
- Risico op contaminatie strengere kwaliteitscontroles!
Eiwitten zijn veel complexer dan klassieke GM
⤷ Analyse veel moeilijker
Eiwitten die denatureren: onomkeerbaar
!! Denk aan bewaartemperatuur
(Verlies van structuur = verlies van functie!!)
2. BASISBEGRIPPEN/TECHNIEKEN IN BIOTECHNOLOGIE &
GENETICA
DNA-RNA
DNA-STRUCTUUR
Primaire structuur = een polynucleotide-structuur
Vorming van 3’-5’-fosfodiëster verbinding tussen nucleotiden
Ontstaan polynucleotide
⤷ Ontstaat een suiker-fosfaatskelet, waarop de basis gebonden zijn via de C 1 v/d
suikermolecule
Secundaire structuur = 2 anti-parallelle ketens
Dubbelstrengige (uitz. Voor enkele virussen met enkelstrengig DNA)
⤷ Eén in 5’ 3’ richting en andere in de 3’ 5’ richting
Beide ketens worden samengehouden door H-brug vorming tussen complementaire
basen
A-T = 2 H-bruggen
C-G = 3 H-bruggen
Chargaffregel: A +G = purines
=1
C+T pyrimidines
Veel virussen: enkelstringig DNA-genoom
⤷ Gebieden met complementariteit met zichzelf
⤷ Vormen interne dubbel helix haarspeld structuren
Veel fragieler, heel onstabiel & makkelijk te breken
Veel genomen zijn circulaire DNA moleculen
⤷ O.a. het geval met de meeste bacteriële genomen, sommige virussen, verschillende
bacteriogafen & plasmiden (ongecontroleerde overerving, ene dochtercel kan er 10
hebben en andere 0)
DENATURATIE-RENATURATIE
Reversibel proces:
Denaturatie
- Thermisch (verwarmen)
- pH wijziging (sterk zuur of alkalisch)
2
, - Destabilisatie met ureum, formamide
H-bruggen uit elkaar: kunnen in juiste omstandigheden weer aan elkaar
!! Van DNA wel reversibel, van eiwitten NIET
Tm waarde of smelttemperatuur
= De temperatuur waarbij de helft v/d basen in een duplex ongepaard zijn
Tm ↗︎naarmate het G, C gehalte toeneemt 3 waterstofbruggen bij G-C i.p.v. 2 H-
bruggen bij A-T
Renaturatie
= Gedenatureerde strengen die geïncubeerd worden bij een temperatuur die ongeveer
25°C onder de Tm waarde ligt, gaan reassociëren
Meting of detectie v/d denaturatie kan gebeuren
door UV-spectrofotometrie
Dubbelstrengig DNA absorbeert minder UV bij 260
nm dan enkelstrengig DNA, waardoor het
denaturatieproces door UV-spectrofotometrie bij
260 nm kan gevolgd worden
Hoeveelheid DNA kan ook geschat worden,
evenals de zuiverheid
- 1 OD260nm = 50 g/mL dubbelstrengig
DNA
- 1 OD260nm = 33 g/mL enkelstrengig DNA = 1.8
- In zuivere DNA-preparaties is de verhouding OD260/OD280
Homologe renaturatie:
- Met een volledig complementair stuk identiek DNA
- Sneller indien concentratie DNA hoger
- Kationen, verlagen elektrostatische afstoting renaturatie hogere Tm
Heterologe renaturatie:
- Met een niet volledig identiek of complementair stuk DNA
- Per mismatch daalt Tm met 1.4°C
!! DNA probeert altijd zo homoloog mogelijk
DNA-REPLICATIE
Snelheid van 50 nucleotiden/s
DNA-baseparing, DNA-templating is het basisprincipe
Enzym: DNA-polymerase (heeft primer nodig om synthese te kunnen starten)
dNTPs: deoxyribonucleotide trifosfaten
Semi-conservatief: elk v/d nieuwe strengen hebben een oude, moederstreng, en een
nieuwe streng
Replicatievork is assymetrisch: “leading” en een “lagging” streng
⤷ Enkel in 5’ 3’ richting
Replicatievorken ontstaan op de oorsprong van replicatie, specifieke DNA-sequenties van
ongeveer 300 nucleotiden lang (A-T rijk, maar 2 H-bruggen: makkelijker “openmaken”)
⤷ Deze binden de initiator proteïnen
⤷ Daarop binden de DNA helicasen (= denaturatie door enzymen)
De dubbele helix wordt uit elkaar gehaald door het DNA-helicase enzym (ATP)
Andere eiwitten houden de gevormde enkele strengen stabiel: single-strand DNA-binding
proteins (SSB)
Een ringvormig eiwit helpt om het DNA-polymerase vast te houden op de DNA-streng
3
, !! Proof-reading capaciteit: om fouten tijdens het overschrijven te voorkomen (herstellen)
⤷ Het 3’OH uiteinde mag GEEN mis-match vertonen, anders kan de synthese niet starten.
⤷ De 3’-5’ proofreading activiteit v/h DNA-polymerase kan deze verwijderen
Synthese enkel in de 5’-3’ richting en een primer is nodig leading & lagging streng
- Leading streng heeft slechts één keer een primer nodig, aan start v/d replicatie
- Lagging streng heeft constant primers nodig
Deze primers worden aangemaakt door het DNA-primase dat RNA-primers aanmaakt van
ong. 10 nucleotiden lang
⤷ Hieruit starten de Okazaki fragmenten
Dankzij 5’-
3’
exonucleas
e act. v/h
DNA
Ligase, zal instaan voor uiteindelijke verbinding van beide fragmenten
Primase, een specifiek RNA synthetiserend enzym verantwoordelijk voor de vorming van
de RNA-primers
DE “POLYMERASE CHAIN REACTION” = PCR
Op punt gesteld in de jaren ’80, door Kary Mullis
Groot probleem in de analyse van genen: zeldzame doelwitten in een complex genoom
bestaande uit meer dan 30 000 genen
⤷ PCR-reactie: enorme kopieën van een bepaalde DNA-sequentie
PRINCIPE VAN DE PCR REACTIE
Gebaseerd op DNA-replicatie
DNA-polymerase gebruikt enkelstrengig DNA als een “template” voor de synthese van
een complementaire nieuwe streng
Deze enkelvoudige DNA strengen kunnen bekomen worden door dubbelstrengig DNA te
verhitten tot bijna kooktemperatuur = denaturatie
DNA-polymerase heeft een klein stukje dubbelstrengig DNA nodig om synthese te starten
(primer), in totaal 2 primers nodig
4
1. INLEIDING
Het gebruik en manipulatie van biologische systemen ter (industriële) bereiding van
natuurlijke grondstoffen en biomassa (en door de mens gebruikt kunnen worden)
Biologische systemen: micro-organismen, plantaardige of dierlijke cellen, enzymen
geïsoleerd uit levende wezens.
NIET: traditionele agricultuur en veeteelt
Biologische systemen reeds duizenden jaren gebruikt.
- Tijdperk waarin op onbewuste wijze gebruik werd gemaakt van bacteriën en gisten
Ter productie van levensmiddelen als bier (fermentatie met gistcellen), wijn, kaas,
yoghurt en azijn
Eindigt 1850: L. Pasteur ontdekte dat micro-organismen de verantwoordelijken
zijn voor bepaalde omzettingen (productie van alcohol uit suikers, verzuring van wijn)
(Op die manier kon bewust gebruik worden gemaakt van biologische systemen, alhoewel de techniek om
contaminaties met vreemde micro-organismen uit te sluiten nog niet gekend was.)
Start TWEEDE periode:
- De introductie van industriële porcessen om grote hoeveelheden glycol, aceton en
citroenzuur aan te maken, massaproductie opgestart van bakkersgist.
- Al deze processen werden niet gehinderd door vreemde micro-organismen.
Start DERDE periode:
- Kennis van aseptische technieken (steriel werken, zodat we enkel het gewenste
bekomen)
Zuivere culturen
Farmaceutische productie van penicillines
Sindsdien werden de metabolieten van tal van micro-organismen beschreven en
geproduceerd
Start VIERDE periode:
- Invoer van recombinante DNA-technieken en de definitieve doorbraak van
plantaardige en dierlijke celculturen in productieprocessen (1970-1980)
Biotechnologie is veel meer dan enkel DNA-manipulaties, alhoewel beide begrippen vaak
verkeerdelijk als synoniem gebruikt worden.
De noodzaak aan massaproductie van oraal werkzame antimicrobiële stoffen leidde tot
de ontwikkeling van kiemverbetering en industriële aseptische technieken.
De invoer van recombinante DNA-technieken (begin ’80), ook genetic engineering
genoemd, betekende een ware doorbraak in de mogelijkheden van de farmaceutische
nijverheid.
DNA manipuleren (stabiele) wijzigingen al dan niet in het genoom van bepaalde cellen
Op industriële schaal recombinante proteïnen aanmaken
Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
⤷ Bepaalde neuro-endocriene boodschappers, lymfokines en bloedproteïnen wereldwijd
klinisch getest worden en therapeutisch gebruikt worden
⤷ Ook recombinante technieken voor: vaccins, mAb en enzymen
GGO = genetisch gemanipuleerde organismen
1
,Biologische GM moeten door EMA goedgekeurd worden
Vb. Insuline, wordt in ons lichaam geproduceerd synthetische humane insuline wordt
geproduceerd m.b.v. recombinant-DNA-technologie
⤷ Menselijk DNA, dat codeert voor menselijke insuline, wordt ingebracht in een E-coli
gastcel
Analyse van deze biogene producten = extreem belangrijk: kwaliteitscontrole!!
- Risico op contaminatie strengere kwaliteitscontroles!
Eiwitten zijn veel complexer dan klassieke GM
⤷ Analyse veel moeilijker
Eiwitten die denatureren: onomkeerbaar
!! Denk aan bewaartemperatuur
(Verlies van structuur = verlies van functie!!)
2. BASISBEGRIPPEN/TECHNIEKEN IN BIOTECHNOLOGIE &
GENETICA
DNA-RNA
DNA-STRUCTUUR
Primaire structuur = een polynucleotide-structuur
Vorming van 3’-5’-fosfodiëster verbinding tussen nucleotiden
Ontstaan polynucleotide
⤷ Ontstaat een suiker-fosfaatskelet, waarop de basis gebonden zijn via de C 1 v/d
suikermolecule
Secundaire structuur = 2 anti-parallelle ketens
Dubbelstrengige (uitz. Voor enkele virussen met enkelstrengig DNA)
⤷ Eén in 5’ 3’ richting en andere in de 3’ 5’ richting
Beide ketens worden samengehouden door H-brug vorming tussen complementaire
basen
A-T = 2 H-bruggen
C-G = 3 H-bruggen
Chargaffregel: A +G = purines
=1
C+T pyrimidines
Veel virussen: enkelstringig DNA-genoom
⤷ Gebieden met complementariteit met zichzelf
⤷ Vormen interne dubbel helix haarspeld structuren
Veel fragieler, heel onstabiel & makkelijk te breken
Veel genomen zijn circulaire DNA moleculen
⤷ O.a. het geval met de meeste bacteriële genomen, sommige virussen, verschillende
bacteriogafen & plasmiden (ongecontroleerde overerving, ene dochtercel kan er 10
hebben en andere 0)
DENATURATIE-RENATURATIE
Reversibel proces:
Denaturatie
- Thermisch (verwarmen)
- pH wijziging (sterk zuur of alkalisch)
2
, - Destabilisatie met ureum, formamide
H-bruggen uit elkaar: kunnen in juiste omstandigheden weer aan elkaar
!! Van DNA wel reversibel, van eiwitten NIET
Tm waarde of smelttemperatuur
= De temperatuur waarbij de helft v/d basen in een duplex ongepaard zijn
Tm ↗︎naarmate het G, C gehalte toeneemt 3 waterstofbruggen bij G-C i.p.v. 2 H-
bruggen bij A-T
Renaturatie
= Gedenatureerde strengen die geïncubeerd worden bij een temperatuur die ongeveer
25°C onder de Tm waarde ligt, gaan reassociëren
Meting of detectie v/d denaturatie kan gebeuren
door UV-spectrofotometrie
Dubbelstrengig DNA absorbeert minder UV bij 260
nm dan enkelstrengig DNA, waardoor het
denaturatieproces door UV-spectrofotometrie bij
260 nm kan gevolgd worden
Hoeveelheid DNA kan ook geschat worden,
evenals de zuiverheid
- 1 OD260nm = 50 g/mL dubbelstrengig
DNA
- 1 OD260nm = 33 g/mL enkelstrengig DNA = 1.8
- In zuivere DNA-preparaties is de verhouding OD260/OD280
Homologe renaturatie:
- Met een volledig complementair stuk identiek DNA
- Sneller indien concentratie DNA hoger
- Kationen, verlagen elektrostatische afstoting renaturatie hogere Tm
Heterologe renaturatie:
- Met een niet volledig identiek of complementair stuk DNA
- Per mismatch daalt Tm met 1.4°C
!! DNA probeert altijd zo homoloog mogelijk
DNA-REPLICATIE
Snelheid van 50 nucleotiden/s
DNA-baseparing, DNA-templating is het basisprincipe
Enzym: DNA-polymerase (heeft primer nodig om synthese te kunnen starten)
dNTPs: deoxyribonucleotide trifosfaten
Semi-conservatief: elk v/d nieuwe strengen hebben een oude, moederstreng, en een
nieuwe streng
Replicatievork is assymetrisch: “leading” en een “lagging” streng
⤷ Enkel in 5’ 3’ richting
Replicatievorken ontstaan op de oorsprong van replicatie, specifieke DNA-sequenties van
ongeveer 300 nucleotiden lang (A-T rijk, maar 2 H-bruggen: makkelijker “openmaken”)
⤷ Deze binden de initiator proteïnen
⤷ Daarop binden de DNA helicasen (= denaturatie door enzymen)
De dubbele helix wordt uit elkaar gehaald door het DNA-helicase enzym (ATP)
Andere eiwitten houden de gevormde enkele strengen stabiel: single-strand DNA-binding
proteins (SSB)
Een ringvormig eiwit helpt om het DNA-polymerase vast te houden op de DNA-streng
3
, !! Proof-reading capaciteit: om fouten tijdens het overschrijven te voorkomen (herstellen)
⤷ Het 3’OH uiteinde mag GEEN mis-match vertonen, anders kan de synthese niet starten.
⤷ De 3’-5’ proofreading activiteit v/h DNA-polymerase kan deze verwijderen
Synthese enkel in de 5’-3’ richting en een primer is nodig leading & lagging streng
- Leading streng heeft slechts één keer een primer nodig, aan start v/d replicatie
- Lagging streng heeft constant primers nodig
Deze primers worden aangemaakt door het DNA-primase dat RNA-primers aanmaakt van
ong. 10 nucleotiden lang
⤷ Hieruit starten de Okazaki fragmenten
Dankzij 5’-
3’
exonucleas
e act. v/h
DNA
Ligase, zal instaan voor uiteindelijke verbinding van beide fragmenten
Primase, een specifiek RNA synthetiserend enzym verantwoordelijk voor de vorming van
de RNA-primers
DE “POLYMERASE CHAIN REACTION” = PCR
Op punt gesteld in de jaren ’80, door Kary Mullis
Groot probleem in de analyse van genen: zeldzame doelwitten in een complex genoom
bestaande uit meer dan 30 000 genen
⤷ PCR-reactie: enorme kopieën van een bepaalde DNA-sequentie
PRINCIPE VAN DE PCR REACTIE
Gebaseerd op DNA-replicatie
DNA-polymerase gebruikt enkelstrengig DNA als een “template” voor de synthese van
een complementaire nieuwe streng
Deze enkelvoudige DNA strengen kunnen bekomen worden door dubbelstrengig DNA te
verhitten tot bijna kooktemperatuur = denaturatie
DNA-polymerase heeft een klein stukje dubbelstrengig DNA nodig om synthese te starten
(primer), in totaal 2 primers nodig
4
