CYTOLOGIE PRACTICUM II
INHOUDSOPGAVE
Gentransfer en Genexpressie ............................................................................................................................ 3
Doelstelling van gentransfer en genexpressie in hogere eukaryotische cellen ................................................ 3
Transfectie, Transductie, Transformatie ........................................................................................................ 3
Basale kloneringsplasmiden en expressieplasmiden ...................................................................................... 4
Basale kloneringsplasmiden....................................................................................................................... 4
Selectie voor de insert ............................................................................................................................... 4
1) Aanwezigheid van 2 antibioticumresistentiegenen ....................................................................... 4
2) Selectie door gebruik te maken van lacZ en alfa – complementatie............................................... 6
Expressieplasmiden ................................................................................................................................... 7
Fusie-eiwit ......................................................................................................................................... 7
Promotor........................................................................................................................................... 8
Tet-on en Tet-off als induceerbare promotors .................................................................................... 9
Transiënte en stabiele transfectie................................................................................................................ 10
Transiënte transfectie ............................................................................................................................. 10
Stabiele transfectie ................................................................................................................................. 11
Specifieke selectie van stabiele transfectanten ........................................................................................ 12
1) Drug – resistentiegen ................................................................................................................. 12
2) Salvage pathway ........................................................................................................................ 12
Transfectietechnieken................................................................................................................................. 13
Keuze van transfectiemethode ................................................................................................................ 19
Detectie van geproduceerde eiwit ............................................................................................................... 19
Rapporteergenstudies ................................................................................................................................. 20
Doelstelling van rapporteergenstudies .................................................................................................... 20
Normalisatie............................................................................................................................................ 21
Mogelijke rapporteergenen ..................................................................................................................... 22
Fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie .................................................................................................. 24
Fluorescentie .............................................................................................................................................. 24
Andere types........................................................................................................................................... 24
Aankleuren van eiwitten met fluorescentie ............................................................................................. 25
Kleuren van cellulaire structuren of processen ..................................................................................... 25
Fluorescentiemicroscoop ............................................................................................................................ 26
Flowcytometrie en celsorting ...................................................................................................................... 27
In vitro celkweek : Tellen en Splitsen ............................................................................................................... 28
1
, Cellen tellen ................................................................................................................................................ 28
Voorbereiding op het tellen..................................................................................................................... 28
Opties om een celcultuur te tellen ....................................................................................................... 28
Gebruik van een Bürker telraam .............................................................................................................. 28
Cellen splitsen ............................................................................................................................................. 29
Oefening (Gelijkaardig op het examen)........................................................................................................ 30
Cytologie Deel Praktijk .................................................................................................................................... 31
Stable and transient transfection of plasmid DNA in eukaryotic cells ........................................................... 31
Preparation of the plasmid DNA .................................................................................................................. 31
WORKFLOW ............................................................................................................................................ 31
Analyse van de DNA concentratie en puurheid ........................................................................................ 32
Subcultivation of Eukartoyic cells ................................................................................................................ 33
Transient transfection Using Calcium phosphate transfection method ......................................................... 33
Principe Calcium phosphate transfection method .................................................................................... 33
Transient transfection using LipofectAMINE ................................................................................................ 34
Principe LipofectAMINE ........................................................................................................................... 34
Transient transfection by Elektrporation ..................................................................................................... 34
Principe Elektrporation ............................................................................................................................ 34
Detection of β – galactosidase by 2 methods ............................................................................................... 35
Histochemische methode → X – gal......................................................................................................... 35
Colorimetrie methode ............................................................................................................................. 35
Detection of GFP by fluorescence microscopy ............................................................................................. 36
Begrippenlijst Cytologie Practicum II ............................................................................................................... 37
2
,GENTRANSFER EN GENEXPRESSIE
DOELSTELLING VAN GENTRANSFER EN GENEXPRESSIE IN HOGERE EUKARYOTISCHE CELLEN
➔ Doelstelling 1: Expressie van eiwitten voor de productie van eukaryotische eiwitten
o Dit eiwit kan dienen als medicijn of als vaccin
o Complexere eiwitten kunnen niet aangemaakt worden in een eenvoudige bacterie cel
▪ Deze dienen aangemaakt te worden in eukaryotische cellen omdat ze zorgen voor
een juiste post – translationele modificatie zoals:
• S -S binding
• Fosforylatie
• Glycolysatie
➔ Doelstelling 2: Bestuderen van het ingebrachte gen (of een gedeelte ervan, vb. de promotor)
o Hierbij kan een gen knock-out of knockdown transfectie uitgevoerd worden
o Zo kan de lokalisatie van een onbekend eiwit bepaald worden
▪ Komt het voor in de kern?
▪ Wat is de functie?
▪ Beïnvloedt het andere eiwitten (Signalisatie)
➔ Doelstelling 3: Optimalisering van bepaalde cellen
o Cellen krijgen een “nieuw gen”
▪ Dit kan een extra gen zijn dat niet aanwezig is in dat type cellen of een gen dat een
defectief gen vervangt
▪ Defectief gen = een gen dat niet meer werkt bijvoorbeeld als gevolg van een mutatie
o Wordt vaak toegepast in in vivo gentherapie
TRANSFECTIE, TRANSDUCTIE, TRANSFORMATIE
Transfectie Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen via niet-virale methodes.
Bvb. Elektroporatie, Ca3(PO4)2
Transductie Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen door gebruik van virussen
Bvb. Retrovirale of adenovirale vectoren
Transformatie Het DNA wordt binnengebracht in gistcellen of bacteriën
Het binnenbrengen van DNA in plantencellen is ook transformatie
Bvb. Via hitteshock of Elektroporatie
➔ De term Transformatie wordt ook gebruikt in de oncologie
o Als er gesproken wordt over getransformeerde cellen (of cellijnen) betekent dit dat normale
cellen gewijzigd (getransformeerd) zijn en dat een tumorcel kan ontstaan
▪ Dit kan het gevolg zijn van een virale infectie of blootstelling aan carcinogene stoffen
3
, BASALE KLONERINGSPLASMIDEN EN EXPRESSIEPLASMIDEN
BASALE KLONERINGSPLASMIDEN
➔ Basale kloneringsplasmiden bevat noodzakelijke onderdelen voor de constructie van een plasmide in
prokaryote cellen
➔ Onderdelen voor de constructie van een plasmide
o Multicloningsite
▪ Knipplaats voor restrictie-enzymen
• Gen inbrengen
o Ori van replicatie
▪ Start van replicatie in prokaryote cel
o Selectie gen vb. antibioticum resistentie gen
➔ Bij aanmaak van cDNA – banken kunnen basale kloneringsplasmiden gebruikt worden
SELECTIE VOOR DE INSERT
1) AANWEZIGHEID VAN 2 ANTIBIOTICUMRESISTENTIEGENEN
➔ Bij het kloneren van het insert in 1 van de 2 restrictiegenen, gaat de resistentie verloren
De bacterie kan groeien in aanwezigheid van De bacterie kan groeien in aanwezigheid van
ampicilline of tetracycline (Tet). Bezit nog ampicilline maar niet meer in aanwezigheid
beide restrictiegenen van tetracycline. Door een insertie van DNA
gaat de resistentie verloren
4
INHOUDSOPGAVE
Gentransfer en Genexpressie ............................................................................................................................ 3
Doelstelling van gentransfer en genexpressie in hogere eukaryotische cellen ................................................ 3
Transfectie, Transductie, Transformatie ........................................................................................................ 3
Basale kloneringsplasmiden en expressieplasmiden ...................................................................................... 4
Basale kloneringsplasmiden....................................................................................................................... 4
Selectie voor de insert ............................................................................................................................... 4
1) Aanwezigheid van 2 antibioticumresistentiegenen ....................................................................... 4
2) Selectie door gebruik te maken van lacZ en alfa – complementatie............................................... 6
Expressieplasmiden ................................................................................................................................... 7
Fusie-eiwit ......................................................................................................................................... 7
Promotor........................................................................................................................................... 8
Tet-on en Tet-off als induceerbare promotors .................................................................................... 9
Transiënte en stabiele transfectie................................................................................................................ 10
Transiënte transfectie ............................................................................................................................. 10
Stabiele transfectie ................................................................................................................................. 11
Specifieke selectie van stabiele transfectanten ........................................................................................ 12
1) Drug – resistentiegen ................................................................................................................. 12
2) Salvage pathway ........................................................................................................................ 12
Transfectietechnieken................................................................................................................................. 13
Keuze van transfectiemethode ................................................................................................................ 19
Detectie van geproduceerde eiwit ............................................................................................................... 19
Rapporteergenstudies ................................................................................................................................. 20
Doelstelling van rapporteergenstudies .................................................................................................... 20
Normalisatie............................................................................................................................................ 21
Mogelijke rapporteergenen ..................................................................................................................... 22
Fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie .................................................................................................. 24
Fluorescentie .............................................................................................................................................. 24
Andere types........................................................................................................................................... 24
Aankleuren van eiwitten met fluorescentie ............................................................................................. 25
Kleuren van cellulaire structuren of processen ..................................................................................... 25
Fluorescentiemicroscoop ............................................................................................................................ 26
Flowcytometrie en celsorting ...................................................................................................................... 27
In vitro celkweek : Tellen en Splitsen ............................................................................................................... 28
1
, Cellen tellen ................................................................................................................................................ 28
Voorbereiding op het tellen..................................................................................................................... 28
Opties om een celcultuur te tellen ....................................................................................................... 28
Gebruik van een Bürker telraam .............................................................................................................. 28
Cellen splitsen ............................................................................................................................................. 29
Oefening (Gelijkaardig op het examen)........................................................................................................ 30
Cytologie Deel Praktijk .................................................................................................................................... 31
Stable and transient transfection of plasmid DNA in eukaryotic cells ........................................................... 31
Preparation of the plasmid DNA .................................................................................................................. 31
WORKFLOW ............................................................................................................................................ 31
Analyse van de DNA concentratie en puurheid ........................................................................................ 32
Subcultivation of Eukartoyic cells ................................................................................................................ 33
Transient transfection Using Calcium phosphate transfection method ......................................................... 33
Principe Calcium phosphate transfection method .................................................................................... 33
Transient transfection using LipofectAMINE ................................................................................................ 34
Principe LipofectAMINE ........................................................................................................................... 34
Transient transfection by Elektrporation ..................................................................................................... 34
Principe Elektrporation ............................................................................................................................ 34
Detection of β – galactosidase by 2 methods ............................................................................................... 35
Histochemische methode → X – gal......................................................................................................... 35
Colorimetrie methode ............................................................................................................................. 35
Detection of GFP by fluorescence microscopy ............................................................................................. 36
Begrippenlijst Cytologie Practicum II ............................................................................................................... 37
2
,GENTRANSFER EN GENEXPRESSIE
DOELSTELLING VAN GENTRANSFER EN GENEXPRESSIE IN HOGERE EUKARYOTISCHE CELLEN
➔ Doelstelling 1: Expressie van eiwitten voor de productie van eukaryotische eiwitten
o Dit eiwit kan dienen als medicijn of als vaccin
o Complexere eiwitten kunnen niet aangemaakt worden in een eenvoudige bacterie cel
▪ Deze dienen aangemaakt te worden in eukaryotische cellen omdat ze zorgen voor
een juiste post – translationele modificatie zoals:
• S -S binding
• Fosforylatie
• Glycolysatie
➔ Doelstelling 2: Bestuderen van het ingebrachte gen (of een gedeelte ervan, vb. de promotor)
o Hierbij kan een gen knock-out of knockdown transfectie uitgevoerd worden
o Zo kan de lokalisatie van een onbekend eiwit bepaald worden
▪ Komt het voor in de kern?
▪ Wat is de functie?
▪ Beïnvloedt het andere eiwitten (Signalisatie)
➔ Doelstelling 3: Optimalisering van bepaalde cellen
o Cellen krijgen een “nieuw gen”
▪ Dit kan een extra gen zijn dat niet aanwezig is in dat type cellen of een gen dat een
defectief gen vervangt
▪ Defectief gen = een gen dat niet meer werkt bijvoorbeeld als gevolg van een mutatie
o Wordt vaak toegepast in in vivo gentherapie
TRANSFECTIE, TRANSDUCTIE, TRANSFORMATIE
Transfectie Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen via niet-virale methodes.
Bvb. Elektroporatie, Ca3(PO4)2
Transductie Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen door gebruik van virussen
Bvb. Retrovirale of adenovirale vectoren
Transformatie Het DNA wordt binnengebracht in gistcellen of bacteriën
Het binnenbrengen van DNA in plantencellen is ook transformatie
Bvb. Via hitteshock of Elektroporatie
➔ De term Transformatie wordt ook gebruikt in de oncologie
o Als er gesproken wordt over getransformeerde cellen (of cellijnen) betekent dit dat normale
cellen gewijzigd (getransformeerd) zijn en dat een tumorcel kan ontstaan
▪ Dit kan het gevolg zijn van een virale infectie of blootstelling aan carcinogene stoffen
3
, BASALE KLONERINGSPLASMIDEN EN EXPRESSIEPLASMIDEN
BASALE KLONERINGSPLASMIDEN
➔ Basale kloneringsplasmiden bevat noodzakelijke onderdelen voor de constructie van een plasmide in
prokaryote cellen
➔ Onderdelen voor de constructie van een plasmide
o Multicloningsite
▪ Knipplaats voor restrictie-enzymen
• Gen inbrengen
o Ori van replicatie
▪ Start van replicatie in prokaryote cel
o Selectie gen vb. antibioticum resistentie gen
➔ Bij aanmaak van cDNA – banken kunnen basale kloneringsplasmiden gebruikt worden
SELECTIE VOOR DE INSERT
1) AANWEZIGHEID VAN 2 ANTIBIOTICUMRESISTENTIEGENEN
➔ Bij het kloneren van het insert in 1 van de 2 restrictiegenen, gaat de resistentie verloren
De bacterie kan groeien in aanwezigheid van De bacterie kan groeien in aanwezigheid van
ampicilline of tetracycline (Tet). Bezit nog ampicilline maar niet meer in aanwezigheid
beide restrictiegenen van tetracycline. Door een insertie van DNA
gaat de resistentie verloren
4
