GEN- EN CELTECHNOLOGIE
Andy Wullaert
LES 1 : Recombinante DNA technologie 2 – 19
LES 2 : In vitro en In vivo genome editing door CRISPR / Cas9 20 – 35
An Hendrix
DEEL 1: Basis celcultuur 36 - 48
DEEL 2: Basis celcultuur 49 – 57
DEEL 3: Basis celcultuur 58 – 68
DEEL 5: Basis celcultuur 69 – 78
Björn Heindryckx
LES 1 79 – 99
Frauke Coppieters
LES 1: MASSIVE PARALLEL SEQUENCING TECHNOLOGIES 100 – 115
LES 2: GENE THERAPY FOR INHERITED DISEASES 116 – 129
Jan Gettemans
LES 1: REVERSED GENETICS 130 – 132
LES 2: ENKEL KETEN ANTILCIHAAM, VHHS OF NANOBODIES 133 – 145
LES 3: DNA-GERELATEERDE TECHNIEKEN 146 - 148
1
, LES 1: RECOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE
(Andy Wullaert)
1. WAT IS GENTECHNOLOGIE?
• Gericht aanpassen van genetische informatie via:
o Klassieke kruisingsschema’s
o Moleculair-biologische technieken
2. INBREEDING
• Inbreeding = kruising tussen verwante individuen
→ leidt tot nakomelingen homozygoot voor meeste eigenschappen
• Doel:
o Consistente expressie van gewenste kenmerken
o Uitschakelen van ongewenste kenmerken
• Nadeel: Blootleggen van schadelijke recessieve allelen
• Voorbeeld: type 1 diabetes bij de mens
3. GENETIC ENGINEERING
• Snelle, betrouwbare methode om frequentie van specifiek allel te verhogen
• Werking:
o DNA van één organisme wordt ingevoegd in gastorganisme
▪ Zelfde soort = genetisch gemodificeerd organisme
▪ Andere soort = transgeen organisme
• Ook genoemd: recombinante DNA technologie
o Recombineren van DNA-fragmenten uit verschillende bronnen
4. BASISMETHODEN IN GENTECHNOLOGIE
• Isolatie/amplificatie van een gen via PCR
• Muteren van een gen via PCR
• Cloneren (overbrengen naar en vermenigvuldigen) van een gen in vector (4 methoden):
1. Klassieke cut and paste
2. TOPO cloning
3. Gateway cloning
4. Gibson assembly cloning
2
, • Soorten vectoren:
o Plasmiden
o BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)
o YACs (Yeast Artificial Chromosomes)
o Virale vectoren
5. PCR – POLYMERASE CHAIN REACTION
• Polymerase Chain Reaction (PCR)
→ Methode voor het amplificeren van een specifieke DNA-sequentie
→ In vitro techniek
• Uitgevonden door: Kary Mullis, nobelprijs in 1993
• Een methode die wordt gebruikt om DNA-sequenties te amplificeren
• De polymerase chain reaction (PCR) kan snel een kleine hoeveelheid DNA (10–50 µl) in een
proefbuisje kloneren
• In minder dan 2 uur wordt 1 DNA-molecule gekopieerd tot meer dan 10⁹ keer (na 30 cycli)
• Componenten vereist:
o DNA-template: bevat het te amplificeren DNA-gebied (de targetregio)
o Twee DNA-oligonucleotiden (primers): bevatten sequenties die complementair zijn aan
de targetregio
o Deoxynucleotide triphosphaten (dNTPs): bouwstenen voor nieuw DNA
o Buffer met divalente kationen (Mg²⁺): essentieel voor de activiteit van het enzym
o Hitte-stabiele DNA-polymerase: zorgt voor herhaalde en selectieve DNA-amplificatie
(kan met of zonder proofreading activity zijn)
• PCR-proces per cyclus
o Denaturatie (95°C): DNA-strengen worden gescheiden.
o Annealing (55°C): Primers binden aan de enkelstrengs DNA-template.
o Extensie (72°C): DNA-polymerase verlengt het DNA vanaf de primer.
o Proces wordt herhaald over meerdere cycli in thermocycler → exponentiële
vermeerdering van het DNA-fragment.
• Taq polymerase werkt enkel van de 3’-kant naar de 5’-kant van de template
(synthese is dus 5’ → 3’)
• Forward en reverse primers:
o Primers binden aan tegenovergestelde strengen.
o Binden altijd in de richting naar de 3’ kant toe van de template.
o Hiermee kan DNA-polymerase een nieuwe streng bouwen in de 5’ naar 3’ richting.
3
, 6. PCR MUTAGENESIS – OVERLAP PCR
• Techniek om gerichte mutaties (puntmutatie, insertie, deletie) in DNA aan te brengen
• Gebaseerd op overlappende primers (B & C) die de mutatie bevatten
• Werking:
1. Twee aparte PCR’s:
▪ Fragment 1 met primers A & B
▪ Fragment 2 met primers C & D
2. Primers B en C overlappen en zijn complementair ➝ fragmenten plakken aan elkaar
3. Tweede PCR met primers A & D ➝ volledig gemuteerd DNA
• Voor mutatie of deletie: B en C moeten complementair zijn!
7. BIG DELETION MUTAGENESIS
• Dia 15 – 23 vb.
• Primers moeten complementair zijn aan het DNA waar ze op binden.
o Forward primer: is gelijk aan een stukje van de bovenstreng (loopt 5’ ➝ 3’)
o Reverse primer: bindt aan de bovenstreng, maar moet passen op de onderstreng
Daarom moet je:
▪ De complementaire volgorde nemen (A⇌T, C⇌G),
▪ En die vervolgens omkeren (reverse), zodat hij ook 5’ ➝ 3’ loopt
4
Andy Wullaert
LES 1 : Recombinante DNA technologie 2 – 19
LES 2 : In vitro en In vivo genome editing door CRISPR / Cas9 20 – 35
An Hendrix
DEEL 1: Basis celcultuur 36 - 48
DEEL 2: Basis celcultuur 49 – 57
DEEL 3: Basis celcultuur 58 – 68
DEEL 5: Basis celcultuur 69 – 78
Björn Heindryckx
LES 1 79 – 99
Frauke Coppieters
LES 1: MASSIVE PARALLEL SEQUENCING TECHNOLOGIES 100 – 115
LES 2: GENE THERAPY FOR INHERITED DISEASES 116 – 129
Jan Gettemans
LES 1: REVERSED GENETICS 130 – 132
LES 2: ENKEL KETEN ANTILCIHAAM, VHHS OF NANOBODIES 133 – 145
LES 3: DNA-GERELATEERDE TECHNIEKEN 146 - 148
1
, LES 1: RECOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE
(Andy Wullaert)
1. WAT IS GENTECHNOLOGIE?
• Gericht aanpassen van genetische informatie via:
o Klassieke kruisingsschema’s
o Moleculair-biologische technieken
2. INBREEDING
• Inbreeding = kruising tussen verwante individuen
→ leidt tot nakomelingen homozygoot voor meeste eigenschappen
• Doel:
o Consistente expressie van gewenste kenmerken
o Uitschakelen van ongewenste kenmerken
• Nadeel: Blootleggen van schadelijke recessieve allelen
• Voorbeeld: type 1 diabetes bij de mens
3. GENETIC ENGINEERING
• Snelle, betrouwbare methode om frequentie van specifiek allel te verhogen
• Werking:
o DNA van één organisme wordt ingevoegd in gastorganisme
▪ Zelfde soort = genetisch gemodificeerd organisme
▪ Andere soort = transgeen organisme
• Ook genoemd: recombinante DNA technologie
o Recombineren van DNA-fragmenten uit verschillende bronnen
4. BASISMETHODEN IN GENTECHNOLOGIE
• Isolatie/amplificatie van een gen via PCR
• Muteren van een gen via PCR
• Cloneren (overbrengen naar en vermenigvuldigen) van een gen in vector (4 methoden):
1. Klassieke cut and paste
2. TOPO cloning
3. Gateway cloning
4. Gibson assembly cloning
2
, • Soorten vectoren:
o Plasmiden
o BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)
o YACs (Yeast Artificial Chromosomes)
o Virale vectoren
5. PCR – POLYMERASE CHAIN REACTION
• Polymerase Chain Reaction (PCR)
→ Methode voor het amplificeren van een specifieke DNA-sequentie
→ In vitro techniek
• Uitgevonden door: Kary Mullis, nobelprijs in 1993
• Een methode die wordt gebruikt om DNA-sequenties te amplificeren
• De polymerase chain reaction (PCR) kan snel een kleine hoeveelheid DNA (10–50 µl) in een
proefbuisje kloneren
• In minder dan 2 uur wordt 1 DNA-molecule gekopieerd tot meer dan 10⁹ keer (na 30 cycli)
• Componenten vereist:
o DNA-template: bevat het te amplificeren DNA-gebied (de targetregio)
o Twee DNA-oligonucleotiden (primers): bevatten sequenties die complementair zijn aan
de targetregio
o Deoxynucleotide triphosphaten (dNTPs): bouwstenen voor nieuw DNA
o Buffer met divalente kationen (Mg²⁺): essentieel voor de activiteit van het enzym
o Hitte-stabiele DNA-polymerase: zorgt voor herhaalde en selectieve DNA-amplificatie
(kan met of zonder proofreading activity zijn)
• PCR-proces per cyclus
o Denaturatie (95°C): DNA-strengen worden gescheiden.
o Annealing (55°C): Primers binden aan de enkelstrengs DNA-template.
o Extensie (72°C): DNA-polymerase verlengt het DNA vanaf de primer.
o Proces wordt herhaald over meerdere cycli in thermocycler → exponentiële
vermeerdering van het DNA-fragment.
• Taq polymerase werkt enkel van de 3’-kant naar de 5’-kant van de template
(synthese is dus 5’ → 3’)
• Forward en reverse primers:
o Primers binden aan tegenovergestelde strengen.
o Binden altijd in de richting naar de 3’ kant toe van de template.
o Hiermee kan DNA-polymerase een nieuwe streng bouwen in de 5’ naar 3’ richting.
3
, 6. PCR MUTAGENESIS – OVERLAP PCR
• Techniek om gerichte mutaties (puntmutatie, insertie, deletie) in DNA aan te brengen
• Gebaseerd op overlappende primers (B & C) die de mutatie bevatten
• Werking:
1. Twee aparte PCR’s:
▪ Fragment 1 met primers A & B
▪ Fragment 2 met primers C & D
2. Primers B en C overlappen en zijn complementair ➝ fragmenten plakken aan elkaar
3. Tweede PCR met primers A & D ➝ volledig gemuteerd DNA
• Voor mutatie of deletie: B en C moeten complementair zijn!
7. BIG DELETION MUTAGENESIS
• Dia 15 – 23 vb.
• Primers moeten complementair zijn aan het DNA waar ze op binden.
o Forward primer: is gelijk aan een stukje van de bovenstreng (loopt 5’ ➝ 3’)
o Reverse primer: bindt aan de bovenstreng, maar moet passen op de onderstreng
Daarom moet je:
▪ De complementaire volgorde nemen (A⇌T, C⇌G),
▪ En die vervolgens omkeren (reverse), zodat hij ook 5’ ➝ 3’ loopt
4
