Practica Moleculaire biologie
1. Practicum: gDNA-isolatie
1.1 Theoretische voorbereiding
Principe gDNA-isolatie:
1. Lyse cellen
Doel: openbreken celmembranen (en/of wanden) om DNA vrij te maken
Methode: Lysis buffer (detergenten, proteïnase K, chaotrope stoffen)
Principe: detergenten verstoren lipide-structuur celmembraan
celinhoud inclusief DNA komt vrij
Proteïnase K
Principe: enzym dat EW afbreekt
Bij DNA-bereiding om cellulaire EW te verwijderen die aan DNA gebonden zijn
of die de isolatie verstoren
Chaotrope stoffen
Principe: stof die opgelost in water de waterstofbruggen tussen watermoleculen
verstoort
Geordende structuur van water neemt af
Destabiliserend effect op macromoleculen (bv EW en nucleïnezuren)
Verzwakt hydrofobe effect
Vb: ureum, ethanol, guanidinium(hydro)chloride (denatuureert RNases en
DNases)
Resultaat: situatie na cellyse met lyse buffer
cellysaat bevat:
o DNA en RNA in waterige oplossing
o Afbraakmateriaal van cel (gedenatureerde EW, suikers)
o Componenten lysebuffer (detergent, proteïnase K, chaotroop agens,…)
2. Verwijderen van contaminanten
Doel: verkrijgen van zuiver DNA-monster (geschikt voor latere analyses)
Methode: selectieve binding en wassen DNA via kolomchromatografie
Principe DNA binding:
Adsorptie aan silicakolom
Bindingsbuffer:
o Samenstelling: zout concentratie stijgt
chaotroop agens pH daalt
o Functie: verwijderen watermantel van DNA en silica
negatieve ladingen worden toegankelijk
vormen (kation)brug tussen negatief geladen silicakolom
Chaotrope zouten: verstoren structuur watermoleculen en verwijderen
watermantel
Natriumionen: vormen positieve bruggen tussen negatieve fosfaatgroepen DNA
en negatieve silanolgroepen (SiOH) op silicamembraan
Alcohol: DNA replicatie door oplosbaarheid buffer te verminderen(versterkt
wegnemen watermantel)
, Lage pH: neutraliseren negatief geladen fosfaatgroepen van DNA en
silanolgroepen
verlaagt afstoting tussen DNA en silicamembraan
Wasbuffers: verwijderen resterende contaminanten
o DNA blijft aan kolom gebonden
o contaminanten worden weggewassen
o enzyminhibitoren worden verwijderd
3. DNA elutie (afzonderen DNA)
Principe: omkeren van bindingsomstandigheden door elutiebuffer met
lage zoutconcentratie en alkalische pH
4. Kwaliteitscontrole
Doel: kwantificeren gDNA-concentratie en beoordelen zuiverheid met
SFM
geschiktheid van monster voor verdere analyse bepalen
Kwantitatief: concentratie bepaling gDNA
Kwalitatief: bepaling zuiverheid gDNA
Principe SFM analyse:
o Nanodrop/ EZ drop
o Aanbrengen <2 µl staal op voetstuk met fotocel
o Staal omsloten met voetstukken met fotocel
druppel vormt ‘cuvet’
o Lichtbron straalt licht uit over breed golflengte spectrum
o Licht gaat doorheen monster
o Systeem meet hoeveelheid licht door monster geabsorbeerd bij bep
golflengte
o Software genereert spectrum en berekend data (DNA concentratie +
zuiverheidwaarden)
Berekeningen SFM anlayse:
o DNA en RNA absorberen licht bij 260 nm λ=260 nm
o Absorbantie = 1 C = 50 ng/µl DNA
= 40 ng/µl RNA
Opbrengst berekenen
o C = m/V m = C*V
o C= A260 * 50 ng/µl m=A260 * 50 ng/µl *V
o Indien staal verdund werd: m=A260 * 50 ng/µl *V*VF
1. Practicum: gDNA-isolatie
1.1 Theoretische voorbereiding
Principe gDNA-isolatie:
1. Lyse cellen
Doel: openbreken celmembranen (en/of wanden) om DNA vrij te maken
Methode: Lysis buffer (detergenten, proteïnase K, chaotrope stoffen)
Principe: detergenten verstoren lipide-structuur celmembraan
celinhoud inclusief DNA komt vrij
Proteïnase K
Principe: enzym dat EW afbreekt
Bij DNA-bereiding om cellulaire EW te verwijderen die aan DNA gebonden zijn
of die de isolatie verstoren
Chaotrope stoffen
Principe: stof die opgelost in water de waterstofbruggen tussen watermoleculen
verstoort
Geordende structuur van water neemt af
Destabiliserend effect op macromoleculen (bv EW en nucleïnezuren)
Verzwakt hydrofobe effect
Vb: ureum, ethanol, guanidinium(hydro)chloride (denatuureert RNases en
DNases)
Resultaat: situatie na cellyse met lyse buffer
cellysaat bevat:
o DNA en RNA in waterige oplossing
o Afbraakmateriaal van cel (gedenatureerde EW, suikers)
o Componenten lysebuffer (detergent, proteïnase K, chaotroop agens,…)
2. Verwijderen van contaminanten
Doel: verkrijgen van zuiver DNA-monster (geschikt voor latere analyses)
Methode: selectieve binding en wassen DNA via kolomchromatografie
Principe DNA binding:
Adsorptie aan silicakolom
Bindingsbuffer:
o Samenstelling: zout concentratie stijgt
chaotroop agens pH daalt
o Functie: verwijderen watermantel van DNA en silica
negatieve ladingen worden toegankelijk
vormen (kation)brug tussen negatief geladen silicakolom
Chaotrope zouten: verstoren structuur watermoleculen en verwijderen
watermantel
Natriumionen: vormen positieve bruggen tussen negatieve fosfaatgroepen DNA
en negatieve silanolgroepen (SiOH) op silicamembraan
Alcohol: DNA replicatie door oplosbaarheid buffer te verminderen(versterkt
wegnemen watermantel)
, Lage pH: neutraliseren negatief geladen fosfaatgroepen van DNA en
silanolgroepen
verlaagt afstoting tussen DNA en silicamembraan
Wasbuffers: verwijderen resterende contaminanten
o DNA blijft aan kolom gebonden
o contaminanten worden weggewassen
o enzyminhibitoren worden verwijderd
3. DNA elutie (afzonderen DNA)
Principe: omkeren van bindingsomstandigheden door elutiebuffer met
lage zoutconcentratie en alkalische pH
4. Kwaliteitscontrole
Doel: kwantificeren gDNA-concentratie en beoordelen zuiverheid met
SFM
geschiktheid van monster voor verdere analyse bepalen
Kwantitatief: concentratie bepaling gDNA
Kwalitatief: bepaling zuiverheid gDNA
Principe SFM analyse:
o Nanodrop/ EZ drop
o Aanbrengen <2 µl staal op voetstuk met fotocel
o Staal omsloten met voetstukken met fotocel
druppel vormt ‘cuvet’
o Lichtbron straalt licht uit over breed golflengte spectrum
o Licht gaat doorheen monster
o Systeem meet hoeveelheid licht door monster geabsorbeerd bij bep
golflengte
o Software genereert spectrum en berekend data (DNA concentratie +
zuiverheidwaarden)
Berekeningen SFM anlayse:
o DNA en RNA absorberen licht bij 260 nm λ=260 nm
o Absorbantie = 1 C = 50 ng/µl DNA
= 40 ng/µl RNA
Opbrengst berekenen
o C = m/V m = C*V
o C= A260 * 50 ng/µl m=A260 * 50 ng/µl *V
o Indien staal verdund werd: m=A260 * 50 ng/µl *V*VF
