H6: emissie(spectro)fotometrie
Moleculaire emissie (fluometrie)
Principe van fluorescentie
Luminescentie: moleculen absorberen licht van hoge energie (korte
golflengte, hoge frequentie) en zenden licht uit van lagere energie
(langere golflengte) (E = h.v)
Fluorescentie: emissie gebeurt zeer snel na excitatie (10⁻¹² tot 10⁻⁹ s)
o Fluorescerende stoffen
Fosforescentie: emissie gebeurt traag (10⁻⁸s tot weken na excitatie)
Meting van het uitgezonden licht:
Meting van het uitgezonden licht door fluorescerende stoffen kent
vooral de analytische toepasseing
Meting gebeurt door een (spectro)fluorimeter = emissiemeting
(fluorescentie-intensiteit IF wordt gemeten)
o In gunstige omstandigheden: IF is evenredig met de concentratie
van de stof in oplossing
Elektronische toestanden
EI₁ = grondtoestand van het molecuul
EI₂ = hogere elektronische toestand, bereikbaar door absorptie van UV-
of zichtbaar licht
Elke elektronische toestand bevat meerdere vibratie- en
rotatietoestanden
Excitatie en terugval
Moleculen absorberen licht (afhankelijk van golflengte) → gaan naar een
hogere energietoestand (exciteren)
Aangeslagen toestand is instabiel → molecuul keert terug naar
grondtoestand (Er) en geeft energie af (meestal onder de vorm van
warmte)
Bij fluorescerende stoffen
Deel van de energie gaat verloren als warmte (stralingsloze overgang
binnen dezelfde elektronische toestand EB)
Daarna volgt fluorescentie: terugval naar grondtoestand met uitzending
van licht
Drie fasen van fluorescentie
Excitatie door geschikte elektromagnetische straling
Desactivatie: aangeslagen moleculen hebben een energieverlies door
warmte (botsingen met andere moleculen)
Emissie: fluorescentielicht bij terugval naar grondtoestand
, Belangrijke relatie
h⋅ c
→ λF> λA
Omdat Eexcitatie > Eemissie, geldt: E = h ⋅ v=
λ
(emissie heeft langere golflengte dan absorptie)
Fluorimetrie
Absorptiespectrum valt niet samen met het emissiespectrum (van
dezelfde stof)
Gebruik van monochromatoren/monochromator:
o Primair filter/monochromator: kiest excitatiegolflengte
o Secundair filter/monochromator: selecteert uitgezonden straling
Vaak: excitatie met UV → emissie in zichtbaar licht
Apparatuur
Meetprincipe
Fluorescentielicht wordt in alle richtingen uitgezonden → niet alles kan
gemeten worden
Meting gebeurt meestal onder 90° t.o.v. de invallende lichtbundel (I 0)
om storingen door doorgelaten licht (It) te vermijden
Fluorescentie-intensiteit (IF) is klein en evenredig met concentratie
alleen bij lage concentraties (10⁻⁹ tot 10⁻⁵ mol/L)
Belangrijke componenten van een fluorimeter
Lichtbron:
o Hoge intensiteit nodig, want fluorescentie-intensiteit is klein →
vaak kwikdamplamp (UV-lijnen) of xenonlamp (breed spectrum
250–600 nm)
Golflengteselectie:
o Primair filter/monochromator: kiest excitatiegolflengte
o Secundair filter/monochromator: kiest emissiegolflengte
o Filterfluorimeter: gebruikt filters
o Spectrofluorimeter: gebruikt monochromatoren (meer
nauwkeurig)
Detector:
o Zeer gevoelig → meestal fotovermenigvuldigingsbuis +
versterking
Meetopstelling:
o Single-beam of double-beam uitvoering
o Speciale kuvet (niet met matte zijkanten)
o Kalibratie: blanco = 0, referentie = 100, dan ijkreeks en
onbekende stalen
Toepassingen
Moleculaire emissie (fluometrie)
Principe van fluorescentie
Luminescentie: moleculen absorberen licht van hoge energie (korte
golflengte, hoge frequentie) en zenden licht uit van lagere energie
(langere golflengte) (E = h.v)
Fluorescentie: emissie gebeurt zeer snel na excitatie (10⁻¹² tot 10⁻⁹ s)
o Fluorescerende stoffen
Fosforescentie: emissie gebeurt traag (10⁻⁸s tot weken na excitatie)
Meting van het uitgezonden licht:
Meting van het uitgezonden licht door fluorescerende stoffen kent
vooral de analytische toepasseing
Meting gebeurt door een (spectro)fluorimeter = emissiemeting
(fluorescentie-intensiteit IF wordt gemeten)
o In gunstige omstandigheden: IF is evenredig met de concentratie
van de stof in oplossing
Elektronische toestanden
EI₁ = grondtoestand van het molecuul
EI₂ = hogere elektronische toestand, bereikbaar door absorptie van UV-
of zichtbaar licht
Elke elektronische toestand bevat meerdere vibratie- en
rotatietoestanden
Excitatie en terugval
Moleculen absorberen licht (afhankelijk van golflengte) → gaan naar een
hogere energietoestand (exciteren)
Aangeslagen toestand is instabiel → molecuul keert terug naar
grondtoestand (Er) en geeft energie af (meestal onder de vorm van
warmte)
Bij fluorescerende stoffen
Deel van de energie gaat verloren als warmte (stralingsloze overgang
binnen dezelfde elektronische toestand EB)
Daarna volgt fluorescentie: terugval naar grondtoestand met uitzending
van licht
Drie fasen van fluorescentie
Excitatie door geschikte elektromagnetische straling
Desactivatie: aangeslagen moleculen hebben een energieverlies door
warmte (botsingen met andere moleculen)
Emissie: fluorescentielicht bij terugval naar grondtoestand
, Belangrijke relatie
h⋅ c
→ λF> λA
Omdat Eexcitatie > Eemissie, geldt: E = h ⋅ v=
λ
(emissie heeft langere golflengte dan absorptie)
Fluorimetrie
Absorptiespectrum valt niet samen met het emissiespectrum (van
dezelfde stof)
Gebruik van monochromatoren/monochromator:
o Primair filter/monochromator: kiest excitatiegolflengte
o Secundair filter/monochromator: selecteert uitgezonden straling
Vaak: excitatie met UV → emissie in zichtbaar licht
Apparatuur
Meetprincipe
Fluorescentielicht wordt in alle richtingen uitgezonden → niet alles kan
gemeten worden
Meting gebeurt meestal onder 90° t.o.v. de invallende lichtbundel (I 0)
om storingen door doorgelaten licht (It) te vermijden
Fluorescentie-intensiteit (IF) is klein en evenredig met concentratie
alleen bij lage concentraties (10⁻⁹ tot 10⁻⁵ mol/L)
Belangrijke componenten van een fluorimeter
Lichtbron:
o Hoge intensiteit nodig, want fluorescentie-intensiteit is klein →
vaak kwikdamplamp (UV-lijnen) of xenonlamp (breed spectrum
250–600 nm)
Golflengteselectie:
o Primair filter/monochromator: kiest excitatiegolflengte
o Secundair filter/monochromator: kiest emissiegolflengte
o Filterfluorimeter: gebruikt filters
o Spectrofluorimeter: gebruikt monochromatoren (meer
nauwkeurig)
Detector:
o Zeer gevoelig → meestal fotovermenigvuldigingsbuis +
versterking
Meetopstelling:
o Single-beam of double-beam uitvoering
o Speciale kuvet (niet met matte zijkanten)
o Kalibratie: blanco = 0, referentie = 100, dan ijkreeks en
onbekende stalen
Toepassingen
