Biotechnologie II - LAB - samenvatting

Biotechnologie 2 lab
Lab 1: gDNA-isolatie
Principe = silica membraan technologie




Gram + zijn moeilijk te lyseren  sterke complexe celwand
 mechanische verstoring van celwandstructuur met behulp van beads
Elutie buffer BE: Tris-EDTA of Tris-HCl  maakt DNA los van kolom
Lysis buffer MG: chaotropische zouten  denaturatie eiwitten en cellysis
Wasbuffer B5: onzuiverheden verwijderen
1. Preparatie:
⁃ Bacteriesuspensie centrifugeren
⁃ SN weg
⁃ Toevoegen buffer BE
2. Lysis
⁃ Suspensie naar NucleoSpin Bead Tube Type B (kit)
⁃ Voeg Buffer MG toe
⁃ Voeg vloeibaar Proteinase K
 Degradeert eiwitten die het DNA omringen en kunnen
beschadigen
 Bv: nucleasen
⁃ Zet het op de swing mill en centrifugeren
3. Bindingscondities aanpassen
⁃ Nog Buffer MG toevoegen
⁃ Centrifugeren
4. Bind DNA
⁃ Breng SN over naar NucleoSpin Microbial DNA Column
⁃ Centrifugeren
5. Wassen van Silica membraan
⁃ 1ste keer met Buffer BW en centrifugeren
⁃ 2de keer met Buffer B5 en centrifugeren
6. Droog Silica membraan
⁃ Centrifugeren
7. Elueer het DNA
⁃ Plaats de Nucleospin Column in nuclease vrije buisje
⁃ Voeg Buffer BE, incubeer en centrifugeer
8. Meet absorbantie
Soorten pipetten

,  Air-displacement pipet
o Luchtkolom tussen vloeistof en zuiger
 Positive-displacement pipet
o Direct contact tussen vloeistof en zuiger
o Voordelen:
 Voor viskeuze vloeistoffen en vloeistoffen met hoge
dampspanning
 Geen luchtkolom  weinig invloed externe factoren
o Nadelen:
 Risico op contaminatie
 Hele cap verwisselen (duurder)


Lab 2: qPCR
Maltose binding protein (MBP)
 Onderdeel van het maltose/maltodextrinesysteem in E. coli (opname en
katabolisme van maltodextrines)
 Soms gebruikt als fusieproteïne om oplosbaarheid en folding van andere
recombinante proteïnen te bevorderen
Expressie van recombinant MBP
 Coderende sequentie van MBP gekloond in expressievector
o Ampicillineresistentie
o His-tag aan N-terminaal uiteinde van MCS
o Dubbelde lacO site voor controle van expressie m.b.v. IPTG




o Werking IPTG: induceert lac-operon omdat IPTG de lac-represoor
bindt
 Nu maken de bacteriën het MBP-His-eiwit aan in grote
hoeveelheid
o Oogsten: centrifugeren, SN afpipetteren en pellet invriezen
 Waarom invriezen? Cellen bewaren en inhoud (eiwitten) te
stabiliseren