Moleculaire biologie
1. DNA: deoxyribonucleic acid
1.1 Inleiding
1.1.1 Biochemische definities van het leven
- Afgescheiden van omgeving: celmembraan/wand
- Energieopname en -verbruik
- Groei: evolueren in tijd
- Voortplanting
- Beweging
- Interpretatie van prikkels
- Communicatie: cellen obv mol signalen
1.1.2 Waaruit bestaat een levende cel?
-> proteïne, lipiden, carbohydraten en nucleïnezuren
- Prokaryote cellen
- Eukaryote cellen: opgedeeld in compartimenten door membraan, celkern
1.2 Mijlpalen uit de geschiedenis van de erfelijkheidsleer
1.2.1 Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
- Eerst gedefinieerd: Mendel: overerfbare kenmerken (lange met korte erwten:
eerst enkel lange, daarna 25% korte)
Waarneembare eig tot overerfbare eenheden kunnen terugkomen
Elke cel bevat 2 gekoppelde genen, meerdere allelen mogelijk
Genen kunnen dominant, recessief of intermediair zijn
1.2.2 Link tussen genen en biochemische processen door Garrod
- Alkaptonurie: baby pipi kleurt zwart -> overerving was recessief en te wijten aan defect in gen
- Urine hogere conc homogentisinezuur: normaal afgebroken door enzym
Erfelijke stofwisselingsziekte waarbij 1 defect gen 1 defect enzym
1.2.3 Welke stoffen bevatten de genetische informatie?
- Chromosomen bevatten genen -> eerst componenten cel scheiden
- Cellen homogeniseren: componenten in oplossing
Detergent: celmembraan oplossen
Mechanisch breken (mixer of sonicatie: ultrasoon geluid)
- Oplossing verdelen in fracties
Differentiële centrifuge: gebruik van G-krachten
1. Homogenaat in filter voor grote stukken
2. Centrifugeren met lage rotatie-snelheid: grote organellen naar bodem = pellet,
bovenstaande oplossing = supernatans
3. Pellet in nieuwe bufferoplossing
Supernatans in nieuwe centrifugebuis en tegen hogere snelheid
Densiteitscentrifuge: gebruik van dichtheid organellen
1. In centrifugebuis verschillende lagen met dalende conc sucrose
2. Celhomogenaat bovenop gradiënt
3. Centrifugatie dalen organellen tot zelfde densiteit sucrose
Kan ook door Cesiumchloride (CsCl), concentratiegradiënt door centrifugatie:
zeer kleine verschillen in densiteit meten
- Experiment van Griffith:
S-stam (glad): muis dood
R-stam (ruw): muis leeft
, Heat-killed S-stam: muis leeft
Heat-killed S-stam bij R-stam: muis dood => bacteriën dragers van eig (genen)
uit omgeving opnemen = transformatie
Welke stof uit S-stam verantwoordelijk?
Homogenaat gefractioneerd en apart gemengd met R-stam
=> DNA met R- transformeren naar S-stam
Eerste keer aantonen dat erfelijke eig (genen) vervat in DNA
- Experiment van Hershey-Chase:
" Worden overerfbare eig overgebracht door eiwitten of door DNA van bacteriofaag?
Cultuur E.coli infecteren met bacteriofagen in radioactief fosfaat (in nieuw DNA)
Cultuur E.coli infecteren met bacteriofagen in radioactief zwavel (in nieuw eiwitten)
Centrifugatie: E.coli in pellet (met radioactief fosfaat) en kleine bacteriofagen in supernatans,
radioactief zwavel bleef in oplossing/groeimedium achter
E.coli nieuwe bacteriofagen maken
DNA bevat info over bouwstenen van bacteriofagen
1.3 De structuur van DNA
1.3.1 DNA = suiker + fosfaat + basen
- Cellulair DNA: zeer lange polymeren -> bij opzuivering viskeuze opl
- Deoxyribose / β-D-2-deoxyribose: via fosfodiesterbindingen (fosfaat tussen 3’ ene en 5’ andere)
- Fosfaatgroepen: fosfaat gekoppeld aan 5’ uiteinde van deoxyribose
- Nucleobasen: purines (adenine, guanine) en pyrimidines (thymine, cytosine)
- Nucleoside: base aan ribose via N-β-glycosidische binding (adenosine, guanosine, cytidine,
thymidine en uridine)
- Nucleotide: fosfaatgroep aan 5’ koolstof van ribose (tot 3 via fosfoanhydride bindingen)
dNTPs = deoxyribonucleoside trifosfaten
NTPs = nucleoside trifosfaten: overdragers van biochem energie
1.3.1.1 Andere basen en nucleotiden
- cAMP = cyclisch adenosine monofosfaat (cyclisch 3’-5’-fosfozuurester) synthese door
adenylaatcyclase: α-fosfaat van ATP verbinden met 3’OH van eigen ribose
afbraak door fosfodiesterase: hydrolyse tussen fosfaat en 3’OH
- SAM = S-adenosyl-methionine: donor methylgroep voor basen en eiwitten
- Cafeïne: inhibitor van fosfodiesterase, effecten cAMP versterken
- AZT = 3’-azido-2’-deoxythymidine: inhiberen enzyme voor replicatie HIV
- co-enzyme A: acyltransfer-reacties
- NAD = nicotinamide adenine dinucleotide: elektron transfer
- FAD = flavin adenine dinucleotide: elektron transfer
1.3.2 Eigenschappen van DNA
1.3.2.1 Het model van de B-helix
- Regels van Chargaff: relatieve hoeveelheden van 4 basen gelijk per soort
en A en T zelfde en G en C zelfde hoeveelheid
- Rosalind Franklin: X-straaldiffracties op kristalliseert DNA => helicaal
- Watson en Crick: A en T aan elkaar gekoppeld, net zoals G en C: nieuw model
= DNA dubbelstrengig, vormen dubbele helix en anti-parallel
o Purine steeds aan pyrimidine: afstand in ruggengraat overal gelijk
o Basen naar elkaar gekeerd en negatief geladen fosfaatgroepen aan buitenkant naar water
o Basen zijn complementair genoemd want vormen waterstofbruggen (A-T 2 en G-C 3)
en paren liggen loodrecht op ruggengraat
o Dubbele DNA helix: 10,4 basenparen per winding, 3,4 nm en 2 nm doorsnede
, = B-helix met kleine en grote groeve: ontstaan door N-glycosidebindingen niet diametraal
tegenover elkaar, O-2 van pyrimidine en N-3 van purine steeds naar kleine groeve
o Stabiliteit: groot door vele H-bruggen, basenparen vdW krachten en stapeling basen
zorgt voor stabiliteit doordat polaire opp naar buiten zijn gekeerd
o Strengen H-bruggen verbreken door hoge temp: eerst A-T rijke smelten dan G-C
1.3.2.2 Hoe basenvolgorde noteren
bovenste streng van 5’ naar 3’ noteren, andere streng complementair en antiparallel
palindromische sequentie: geldt bij dubbelstrengige anti-parallelle structuur
niet: TCGAAGCT
wel: TCGATCGA want onderste streng is zelfde seq als deze
1.3.2.3 Hyperchromiciteit en hybridisatie
DNA absorbeert UV (260 nm): ds heeft absorptiewaarde 1 en bij ss 1.4
= hyperchromiciteit: absorptie ifv temp zal dit toenemen tot plateauwaarde
Hybridiseren = complementair DNA zal elkaar terug ‘vinden’ na denatureren door temp stijging
en vervolgens traag temp laten dalen
1.3.2.4 DNA electroforese
Om DNA te bekijken, mol met verschillende lengte te scheiden, fragmenten opzuiveren
Gel van agarose = hydrofiel en niet-ionisch en na opwarmen vormt de gel
DNA = negatief en zal migreren van - naar + van elektrisch veld
Grotere fragmenten migreren trager dan kortere => scheiding obv lengte
DNA zichtbaar door ethidiumbromide of SYBRSafe, planaire stof tussen basenparen zitten:
onder UV licht fluoresceren
2. DNA replicatie
Mensen: 5.10ˆ13 cellen met elk 3,3 miljoen basenparen
2.1 Replicatie is semi-conservatief
Door Watson en Crick: tijdens replicatie 2 strengen uiteen en wordt er nieuwe complementaire
streng gemaakt door seq oude = semi-conservatieve replicatie
Aantonen: densiteitscentrifugatie met zware isotoop N15 (niet radioactief maar hogere densiteit)
1: bacteriën groeien in ammoniumzouten met N15
2: na enkele generaties bacteriën met DNA met hogere densiteit
3: mbv densiteitscentrifugatie (CsCl gradiënt) DNA N15 scheiden en opsporen door licht (260nm)
4: bacteriën met DNA N15 in medium met (normale) N14
5: na eerste deling nieuwe DNA lichter, na 2x DNA in 2 verschillende densiteiten
Enkel te verklaren als DNA replicatie semi-conservatief is
2.2 De DNA polymerasen
- Enzymen voor DNA synthese, obv deoxyribonucleotiden DNA maken
- deoxyribonucleoside-monofosfaten (dNMP) activeren door op 5’ 2 fosfaatgroepen toevoegen
door kinasen, ontstaan deoxyribonucleoside-trifosfaten (dNTP)
- bestaande 3’OH nodig voor te polymeriseren (niet zelf starten met replicatie). Eerst verbinding
tussen alfa-fosfaat op 5’ van oude streng en door DNA pol complementaire base geselecteerd
- pyrofosfaat verwijderd van dNTPs, verder gehydrolyseerd tot anorg fosfaat
= onomkeerbaar en hierdoor ook polymerisatie van 5’ naar 3’
1. DNA: deoxyribonucleic acid
1.1 Inleiding
1.1.1 Biochemische definities van het leven
- Afgescheiden van omgeving: celmembraan/wand
- Energieopname en -verbruik
- Groei: evolueren in tijd
- Voortplanting
- Beweging
- Interpretatie van prikkels
- Communicatie: cellen obv mol signalen
1.1.2 Waaruit bestaat een levende cel?
-> proteïne, lipiden, carbohydraten en nucleïnezuren
- Prokaryote cellen
- Eukaryote cellen: opgedeeld in compartimenten door membraan, celkern
1.2 Mijlpalen uit de geschiedenis van de erfelijkheidsleer
1.2.1 Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
- Eerst gedefinieerd: Mendel: overerfbare kenmerken (lange met korte erwten:
eerst enkel lange, daarna 25% korte)
Waarneembare eig tot overerfbare eenheden kunnen terugkomen
Elke cel bevat 2 gekoppelde genen, meerdere allelen mogelijk
Genen kunnen dominant, recessief of intermediair zijn
1.2.2 Link tussen genen en biochemische processen door Garrod
- Alkaptonurie: baby pipi kleurt zwart -> overerving was recessief en te wijten aan defect in gen
- Urine hogere conc homogentisinezuur: normaal afgebroken door enzym
Erfelijke stofwisselingsziekte waarbij 1 defect gen 1 defect enzym
1.2.3 Welke stoffen bevatten de genetische informatie?
- Chromosomen bevatten genen -> eerst componenten cel scheiden
- Cellen homogeniseren: componenten in oplossing
Detergent: celmembraan oplossen
Mechanisch breken (mixer of sonicatie: ultrasoon geluid)
- Oplossing verdelen in fracties
Differentiële centrifuge: gebruik van G-krachten
1. Homogenaat in filter voor grote stukken
2. Centrifugeren met lage rotatie-snelheid: grote organellen naar bodem = pellet,
bovenstaande oplossing = supernatans
3. Pellet in nieuwe bufferoplossing
Supernatans in nieuwe centrifugebuis en tegen hogere snelheid
Densiteitscentrifuge: gebruik van dichtheid organellen
1. In centrifugebuis verschillende lagen met dalende conc sucrose
2. Celhomogenaat bovenop gradiënt
3. Centrifugatie dalen organellen tot zelfde densiteit sucrose
Kan ook door Cesiumchloride (CsCl), concentratiegradiënt door centrifugatie:
zeer kleine verschillen in densiteit meten
- Experiment van Griffith:
S-stam (glad): muis dood
R-stam (ruw): muis leeft
, Heat-killed S-stam: muis leeft
Heat-killed S-stam bij R-stam: muis dood => bacteriën dragers van eig (genen)
uit omgeving opnemen = transformatie
Welke stof uit S-stam verantwoordelijk?
Homogenaat gefractioneerd en apart gemengd met R-stam
=> DNA met R- transformeren naar S-stam
Eerste keer aantonen dat erfelijke eig (genen) vervat in DNA
- Experiment van Hershey-Chase:
" Worden overerfbare eig overgebracht door eiwitten of door DNA van bacteriofaag?
Cultuur E.coli infecteren met bacteriofagen in radioactief fosfaat (in nieuw DNA)
Cultuur E.coli infecteren met bacteriofagen in radioactief zwavel (in nieuw eiwitten)
Centrifugatie: E.coli in pellet (met radioactief fosfaat) en kleine bacteriofagen in supernatans,
radioactief zwavel bleef in oplossing/groeimedium achter
E.coli nieuwe bacteriofagen maken
DNA bevat info over bouwstenen van bacteriofagen
1.3 De structuur van DNA
1.3.1 DNA = suiker + fosfaat + basen
- Cellulair DNA: zeer lange polymeren -> bij opzuivering viskeuze opl
- Deoxyribose / β-D-2-deoxyribose: via fosfodiesterbindingen (fosfaat tussen 3’ ene en 5’ andere)
- Fosfaatgroepen: fosfaat gekoppeld aan 5’ uiteinde van deoxyribose
- Nucleobasen: purines (adenine, guanine) en pyrimidines (thymine, cytosine)
- Nucleoside: base aan ribose via N-β-glycosidische binding (adenosine, guanosine, cytidine,
thymidine en uridine)
- Nucleotide: fosfaatgroep aan 5’ koolstof van ribose (tot 3 via fosfoanhydride bindingen)
dNTPs = deoxyribonucleoside trifosfaten
NTPs = nucleoside trifosfaten: overdragers van biochem energie
1.3.1.1 Andere basen en nucleotiden
- cAMP = cyclisch adenosine monofosfaat (cyclisch 3’-5’-fosfozuurester) synthese door
adenylaatcyclase: α-fosfaat van ATP verbinden met 3’OH van eigen ribose
afbraak door fosfodiesterase: hydrolyse tussen fosfaat en 3’OH
- SAM = S-adenosyl-methionine: donor methylgroep voor basen en eiwitten
- Cafeïne: inhibitor van fosfodiesterase, effecten cAMP versterken
- AZT = 3’-azido-2’-deoxythymidine: inhiberen enzyme voor replicatie HIV
- co-enzyme A: acyltransfer-reacties
- NAD = nicotinamide adenine dinucleotide: elektron transfer
- FAD = flavin adenine dinucleotide: elektron transfer
1.3.2 Eigenschappen van DNA
1.3.2.1 Het model van de B-helix
- Regels van Chargaff: relatieve hoeveelheden van 4 basen gelijk per soort
en A en T zelfde en G en C zelfde hoeveelheid
- Rosalind Franklin: X-straaldiffracties op kristalliseert DNA => helicaal
- Watson en Crick: A en T aan elkaar gekoppeld, net zoals G en C: nieuw model
= DNA dubbelstrengig, vormen dubbele helix en anti-parallel
o Purine steeds aan pyrimidine: afstand in ruggengraat overal gelijk
o Basen naar elkaar gekeerd en negatief geladen fosfaatgroepen aan buitenkant naar water
o Basen zijn complementair genoemd want vormen waterstofbruggen (A-T 2 en G-C 3)
en paren liggen loodrecht op ruggengraat
o Dubbele DNA helix: 10,4 basenparen per winding, 3,4 nm en 2 nm doorsnede
, = B-helix met kleine en grote groeve: ontstaan door N-glycosidebindingen niet diametraal
tegenover elkaar, O-2 van pyrimidine en N-3 van purine steeds naar kleine groeve
o Stabiliteit: groot door vele H-bruggen, basenparen vdW krachten en stapeling basen
zorgt voor stabiliteit doordat polaire opp naar buiten zijn gekeerd
o Strengen H-bruggen verbreken door hoge temp: eerst A-T rijke smelten dan G-C
1.3.2.2 Hoe basenvolgorde noteren
bovenste streng van 5’ naar 3’ noteren, andere streng complementair en antiparallel
palindromische sequentie: geldt bij dubbelstrengige anti-parallelle structuur
niet: TCGAAGCT
wel: TCGATCGA want onderste streng is zelfde seq als deze
1.3.2.3 Hyperchromiciteit en hybridisatie
DNA absorbeert UV (260 nm): ds heeft absorptiewaarde 1 en bij ss 1.4
= hyperchromiciteit: absorptie ifv temp zal dit toenemen tot plateauwaarde
Hybridiseren = complementair DNA zal elkaar terug ‘vinden’ na denatureren door temp stijging
en vervolgens traag temp laten dalen
1.3.2.4 DNA electroforese
Om DNA te bekijken, mol met verschillende lengte te scheiden, fragmenten opzuiveren
Gel van agarose = hydrofiel en niet-ionisch en na opwarmen vormt de gel
DNA = negatief en zal migreren van - naar + van elektrisch veld
Grotere fragmenten migreren trager dan kortere => scheiding obv lengte
DNA zichtbaar door ethidiumbromide of SYBRSafe, planaire stof tussen basenparen zitten:
onder UV licht fluoresceren
2. DNA replicatie
Mensen: 5.10ˆ13 cellen met elk 3,3 miljoen basenparen
2.1 Replicatie is semi-conservatief
Door Watson en Crick: tijdens replicatie 2 strengen uiteen en wordt er nieuwe complementaire
streng gemaakt door seq oude = semi-conservatieve replicatie
Aantonen: densiteitscentrifugatie met zware isotoop N15 (niet radioactief maar hogere densiteit)
1: bacteriën groeien in ammoniumzouten met N15
2: na enkele generaties bacteriën met DNA met hogere densiteit
3: mbv densiteitscentrifugatie (CsCl gradiënt) DNA N15 scheiden en opsporen door licht (260nm)
4: bacteriën met DNA N15 in medium met (normale) N14
5: na eerste deling nieuwe DNA lichter, na 2x DNA in 2 verschillende densiteiten
Enkel te verklaren als DNA replicatie semi-conservatief is
2.2 De DNA polymerasen
- Enzymen voor DNA synthese, obv deoxyribonucleotiden DNA maken
- deoxyribonucleoside-monofosfaten (dNMP) activeren door op 5’ 2 fosfaatgroepen toevoegen
door kinasen, ontstaan deoxyribonucleoside-trifosfaten (dNTP)
- bestaande 3’OH nodig voor te polymeriseren (niet zelf starten met replicatie). Eerst verbinding
tussen alfa-fosfaat op 5’ van oude streng en door DNA pol complementaire base geselecteerd
- pyrofosfaat verwijderd van dNTPs, verder gehydrolyseerd tot anorg fosfaat
= onomkeerbaar en hierdoor ook polymerisatie van 5’ naar 3’
