Biokatalyse en enzymtechnologie
Gegeven door Prof. dr. Tom Desmet
HOOFDSTUK I: Intro
1. Definities
Biokatalyse en enzymtechnologie = gebruik van enzymen om chemische reacties te katalyseren chemische katalysatoren
→ geeft economisch en ecologisch voordeel
Biokatalyse = gebruik maken van bepaald enzym om precursor in 1 stap in product om te zetten
Biotransformatie = enzym in cel laten zitten om in 1 stap product te krijgen (bv stabieler)
wel niet heek het cel metabolisme gebruikt = whole cel biotransformation
Fermentatie = werken met intacte cel dat op voedingsbodem leeft en in #stappen product krijgt
2. Geschiedenis
Het toepassen en gebruiken van enzymen liep voor op de kennis
Bv maken van wijn, kaas, …
Wouden melk opslaan in magen van kalven → zit stremsel (rennet nu) in = complex van spijsverteringsenzymen
In het stremsel zit chemosine dat moedermelkeiwitten (caseïne) afbreekt
Krijgt klonering van melkeiwit (wrongel) dat kaas geef
▪ Pakte extract uit gerst om de hydrolyse van gerst
beter te begrijpen
▪ Voegde hier meel-extract aan toe bv en zag dat de ▪ Lock-key hypothese = sleutel slot
afbraak sneller verliep ▪ Hypothese dat elk enzym een affectiviteit heeft
▪ Extract kreeg naam diastase = cocktail van voor 1 substraat → halve eeuw later bevestigd al
amylasen (zetmeel afbreken) komt induced fit er ook bij
Payer – diastase Fischer
Buchner – zymase
▪ Wil aantonen dat je biologie wel kan zien als
aaneenschakelijk van chemische reacties
▪ Dood cellen af en haalt enzymatische werking eruit →
kon fermentatie nabootsen met het extract zonder
levenskracht nodig te hebben vis vitilis
▪ Zijn extract = zymase = gistextract Cel-extract = inhoud van de cel
Vanaf de 20ste eeuw begint de industriële toepassing van enzymen
Diastase (gist-extract) voor alcohol en bakken → graan afbreken tot vergistbare suikers → CO2↑ + ethanol↑
Rennet voor de bereiding van kaas, vroeger uit magen bij slagers geëxtraheerd
Oropon → protease voor de bereiding van leer, vroeger uit uitwerpselen van honden (pancreas enzym)
o Komt uit pancreas maar probleem in de tijd, pancreas ook nodig voor insuline
o Gingen opzoek naar microb iële enzymen voor Operon uit dier → subtilisine als microbiële vervanger gevoden
BioTex = wasmiddel met enzym subtilisine
o Gebruikt voor bereiding van leder maar ook in waspoeder
o Is een microbieel protease
o Was revolutionair voor overschakeling op microbiële enzymen
o Novo was eerste en nogsteeds markleider (70% van industriële enzymen, nu Novozyme)
,3. Voordelen enzymen
▪ Ze zijn selectief
o Chemo-selectief → zullen maar 1 bepaalde reactie katalyseren ≠ geen nevenreacties (zie later)
o Regio-selectief → als er 2 hydrolyseerbare regio’s zijn op een substraat zullen ze er maar 1 hydrolyseren chemie
o Enantio-selectief → kunnen onderscheidt maken tussen optische isomeren (D/L) zeer grote uitdaging voor chemie
van groot belang in de farmacie en geneeskunde
▪ Katalyseren bij milde reactiecondities (pH 7 en 30°C) → aanpasbaarheid via type enzym uit bepaald MO
▪ Zijn biodegradeerbaar toxisch
▪ Zeer efficiënt (108)
4. Vooroordelen enzymen
Naast de voordelen dat enzymen met zich meebrengen zijn chemici ook skeptisch en hebben ze vooroordelen voor het gebruik ervan
▪ Enzymen zijn duur
▪ Enzymen zijn onstabiel → kunnen denatureren (eiwit) met juist gebruik maanden hergebruiken
▪ Slechts 500 commercieel beschikbaar → van de gekende 5000 enzymsoorten zijn, vormt echter geen limitatie
bestelt gewoon gen dat het enzym codeert en maakt het zelf
▪ Kunnen enkel natuurlijk substraten binden → kan ze engineeren om synthetische substraten te binden
▪ Vereisen soms rare en dure cofactoren → regeneratie of biotransformatie gebruiken (cofactoren aanwezig in de cel)
5. Markt en toepassingen
27% voedsel → eten lekkerder maken bv
37% detergent → waspoeders, wasmiddelen, niet uitgebreid in cursus
8% andere → uitgebreid in cursus, om welbepaalde moleculen te maken, extraheren
en te gebruiken, vormt dus grootste wetenschappelijke uitdaging (bulk specifiek)
Enkele zaken uitgepikt
▪ Detergent: cellulase om losse vezels af te knippen aan oppervlakte van kledij (pluisjes)
▪ Voedsel: protease om zacht vlees te maken → indianen in Amazonewoud deden dit al: vlees in papaya-extract weken (uit plant!)
▪ Voedsel: galactosidase om lactose te hydrolyseren in melk, dus voor voorbehandeling melk om te verteren (Afrika, Azië)
▪ Voedsel: xylose isomerase voor de bereiding van High-fructose corn syrop (HFCS), nieuwe afzetmarkt VS om teveel aan mais te
verwerken: zetmeel → glucose → fructose → sucrose (HFCS) ≈ tafelzoet, gebruikt om frisdranken te zoeten (VS cola Europa)
▪ Voedsel: lipasen voor modificatie lipiden → productie margarine (smeerbare boter op kamer T), of fake chocolade (cacao te duur)
▪ Veevoeder: enzymen om voer al wat af te breken en zo beter verteerbaar te maken
▪ Textiel: cellulasen om witte strepen in denim te krijgen, vroeger met keien gewassen
▪ Chemie en geneeskunde: cursus vooral hieromtrent ‘other’, bv penicillinase dat penicilline afbreekt als patiënt allergisch is,
productie antibiotica, acrylamide, bioethanol, ….
Enzymen worden op heel grote schaal toegepast want worden voor zeer diverse doeleinden en producten gebruikt
▪ 25% producten via whole cel biotransformation
▪ 50% producten via immobilisatie
HOOFDSTUK II: Characterisation (hoe werkt enzym + uitleg praktische uitwerking)
1. Classificatie
Enzymen kunnen op 3 niveaus ingedeeld worden
▪ Obv sequentie = protein families = Pfam
▪ Obv structuur = 4 SCOP-klassen
▪ Obv reactie = 6 EC-klassen
,Protein families (Pfam)
Onderverdeling van enzymen obv hun sequentie in protein families
Zegt echter wel niets over structuur en functie
kan wel met enige zekerheid zeggen dat functie en structuur van 2 enzymen zelfde is als sequenties voor > 25% op elkaar lijken
Maar kan hierdoor wel verkeerd indelen → achteraf indelen in superfamilies = clans om die fouten recht te zetten
SCOP-classificatie
Groeperen van enzymen obv hun structuur: 𝛼-helix, β-vouwblad, …
Een specifieke groep eruit gehaald: (𝛃/𝛂)-TIM barrel
Deze structuur komt heel vaak voor (10% alle enzymen)
Naam afgeleid van triose fosfaat isomerase
→ eerste waarin structuur ontdekt is (belang in eiwit-glycosylatie)
Is een symmetrische molecule met telkens een 𝛼-helix, β-vouwblad
afgewisseld en dit 8 keer → (𝛃/𝛂)8 = TIM-barrel
Deze liggen opgerold in 2 lagen (cirkels) met β aan de binnenkant
Belangrijk: functionaliteit bij TIM-barrel wordt niet bepaald door de
structuur zelf want deze komt voor in verschillende families, maar wordt
bepaald door de lusstructuren + binnenste niet hol maar opgevuld met AZ residues
Enzyme Commision (EC) classificatie
Classificatie van enzymen obv de reactie die ze katalyseren
Classificatie bestaat uit 6 klassen met 3 subniveaus: subklasse – subsubklasse – reactie (bv EC 2.2.1.2)
probleem is dat sommige enzymen meerdere reacties katalyseren
EC 1 Oxidoreductasen redoxreacties katalyseren (dehydrogenasen, …)
EC 2 Transferasen functionele groep van 1 substraat naar ander transfereren, ATP nodig
EC 3 Hydrolasen splitsen binding met behulp van water (proteasen, lipasen, …)
EC 4 Lyasen splitsen binding zonder water via eliminatiereactie (dehydratasen, aldolasen, …)
EC 5 Isomerasen zet 2 isomeren om in elkaar → soort transferasen maar nu op zelfde substraat
EC 6 Ligasen gaan binding maken en hebben daarvoor ATP nodig → vorming energierijke bindingen
Merk op: verschil gebruik ATP bij 2/6 → (2) gebruiken ATP vaak als substraat, (6) doet niets met fosfaatgroep, ATP puur als E-bron
2. Mechanisme
Enzym werkt eigenlijk zoals een chemische katalysator
Enige verschil is in feite dat het efficiënter is → Reden? → omdat reactie doorgaat in een actief centrum = katalytisch centrum
Actief centrum = soort afgeschermde micro-omgeving waar andere omstandigheden kunnen gelden
(bv zure hydrolyse in een neutraal milieu bij chemie moet je het milieu eerst zuur maken)
Hierdoor efficiënt, milde condities realiseerbaar, specifiek (chemo-, regio-, stereo-)
én reguleerbaar: inhibitie en activatie
,Specificiteit van enzymen
Enzymen binden specifiek aan 1 (of soms meerdere) substraten via complementariteit tussen beide, 2 methodes
▪ Sleutel/slot = actief centrum rigide en statisch, substraat klikt er als het ware in (Fisher)
▪ Induced fit = bewegende loops, actief centrum is dynamischer in werkelijkheid
o Vroeger door persoon al als hypothese gesteld: hoe kunnen transferasen
vermijden dat bij verplaatsen van een fucntionele groep naar een ander
substraat in waterige omgeving, water de verplaatste groep niet pakt?
o = concept induced fit: actief centrum ‘omarmt’ substraat en pas dan krijg
je katalisatie → vermijdt zo hydrolyse
Belangrijk! Vorm substraat en katalytisch centrum is eigenlijk niet het belangrijkste
Wel → substraat moet complementair zijn met actief centrum obv ladingsverdeling
Dus eerder: secundaire interacties moeten perfect complementair zijn tussen beide (hydrofobe-, H-bruggen, VDW-interacties)
Basis van de katalyse (hoe het werkt en katalytische werking van enzym)
Basis van de katalyse: stabilisatie transitietoestand, verhoging aantal productieve botsingen en actieve uitwisselingen van H en of e-
Stabilisatie transitietoestand
▪ Enzymen verhogen de reactiesnelheid door de activatie-energie Ea te verlagen
o Ze spelen in op de kinetiek (k) maar niet op het evenwicht (K)!
2 belangrijke zaken die uit elkaar gehaald moeten worden
Thermodynamica = willen reageren Kinetiek = kunnen reageren
Alles streeft naar zo laag mogelijke E (2de wet TD) Gaat dus over snelheden en hoe rap we het evenwicht K bereiken, kan
P + Q lagere E-inhoud dan A + B → willen reageren wel op ingespeeld worden (k veranderen)
A+B→P+Q
∆G bepaald hoe graag ze dat willen, hoe lager, hoe Bij de vorming van een product moet een transitietoestand overwonnen
harder de reactie naar rechts ligt, hoe groter het worden = oude bindingen nog niet volledig verbroken, nieuwe nog niet
energieverschil is → bepaald uiteindelijk grote K volledig gevormd = twijfelmoment van naar welke kant ga ik →
afhankelijk van een gegeven temperatuur en de stressmomentje → energiepiek
chemische aard van de stoffen Hoe hoger de berg = activeringsenergie Ea, hoe moeilijker ze kunnen
Belangrijk: er kan niets aan K veranderd worden, reageren → bepaald door kleine k → kunnen hierop inspelen (energie
heeft te maken met structuur P en S, is en blijft zo. naar beneden halen, makkelijker over of terug) → enzym doet dit
Katalyse gaat hier dus niet over, gaat over Veranderd dus niets aan het evenwicht, gewoon hoe gemakkelijk of snel
snelheden en hoe gemakkelijk of snel we tot het je tot het evenwicht K geraakt
evenwicht K geraken (over berg = Ea) Stelling ‘ik heb een ander enzym gevonden dat een hoger rendement
geeft voor die reactie’ → kan niet want is bepaald door thermodynamica
Kan in principe wel als het ene nevenreacties krijgt of bij hogere
temperatuur, maar gaat niet over thermodynamische aard
,Enzymen zullen de transitietoestand verlagen wanneer het enzym perfect complementair is met de transitietoestand
sommige enzymen zullen ook de grondtoestand van het substraat exciteren om ook zo de berg te verlagen = substraat distortie
Theoretisch concept: ABenzymen (jaren 80 idee)
Kunnen we een enzym omschrijven als: een eiwit dat in staat is om heel sterk (hoge affiniteit) een transitietoestand (TS) te binden
Zou willen zeggen dat als we antilichamen (eiwit) creëren dat heel goed met de TS kan reageren we een enzym maken
Dan zouden we voor om het even welke reactie een enzym kunnen creëren = ABenzymen = katalytische antilichamen
Blijkt praktisch niet mogelijk, TS valt niet te isoleren, hoogstens te detecteren + enzym blijkt complexer te zijn dan die definitie
Verhoging aantal productieve botsingen
Enzymen binden en stabiliseren niet enkel de transitietoestand, maar er is ook nog de botsingstheorie
Twee moleculen kunnen pas interageren als met elkaar ontmoeten en met de juiste oriëntatie botsen
→ dus niet elke botsing zal effectief zijn, oriëntatie ook van belang
Gekarakteriseerd door Arhenus vergelijking → enzym speelt op alle componenten in
▪ Z = totaal aantal botsingen (proximiteit)
o Zal Z verhogen (bv 2 substraten of 1tje isoleren in actief centrum → zullen meer botsen)
▪ p = procent aantal botsingen met juiste oriëntatie (oriëntatie)
o p factor is 100¨% want enzym zo ‘ontworpen’ om juiste oriëntatie te hebben
▪ e ^-Ea/RT
= fractie van de botsingen met juiste oriëntatie dat genoeg energie heeft om over de transitietoestand te raken
o Wordt verlaagt want activeringsenergie daalt door binding en stabilisatie van TS → grootste effect (negatieve macht)
Actieve uitwisselingen van H en of e-
Naast verlagen van Ea en dus versnellen van de reactie + verhoging van het aantal productieve botsingen,
neemt het enzym ook actief deel aan de reactie, is niet gewoon TS binden en stabiliseren, zit daar niet gewoon te katalyseren
→ gaat elektronen (e- ) en protonen (H+) uitwisselen met substraat om reactie nog efficiënter te maken
▪ Zuur/base katalyse uitwisseling H+ hydrolasen (EC 3)
▪ Covalente katalyse delen e- hydrolasen (EC 3)
▪ Redox katalyse overdracht e- oxidoreductasen (EC 1)
▪ Metaalkatalyse
,Zuur-base katalyse
-----------------------------
Reactiviteit van aminozuren
belangrijk voor zuur-base reacties, de protonen en elektronen dat enzym uitwisselt (eiwit uit AZ gebouwd) zijn afkomstig van functionele
groepen = de zijkentens, enkel volgende AZ zijn hier toe instaat van de 20 #AZ
▪ Zure AZ → H+ uitwisselen aspartaat, glutamaat
▪ Basische AZ (dragen N) → H+ opnemen lysine, arginine
▪ Hystidine → kan basisch optreden maar niet zo sterk, zal opgenomen H+ vaak direct terug afgeven
o Proton shuttle mechanisme van histidine
o Belangrijkste katalytische AZ, kan makkelijk wisselen tussen geprotoneerde en gedeprotoneerde toestand
o Fungeert dus zo als perfecte zuur-base katalysator die protonen verplaatst (shuttle)
▪ Serine → heeft hydroxylgroep als zijketen (R = OH) is van zichzelf niet echt
reactief maar wel in bijzijn van histidine of aspartaat = katalytische triade
o Vanaf het zijn H verliest → sterk nucleofiel → kan covalente
binding aangaan met substraten (zie covalente katalyse)
-----------------------------
Zuur-base katalyse met enzymen: enzymen kunnen beide tegelijk doen (zuur en basereactie) door micro-omgeving
Zijketens met geschikte AZ nu gebruikt voor de katalytische reactie (uitwisseling H+)
Covalente katalyse
Soms splitsen enzymen reacties op in 2 delen, en gaan tussentijds het substraat
veranker dmv een covalente binding (naast secundaire interacties voor aantrekking)
Het covalent intermediar is entropisch gunstiger
Case-study: serine-protease (hydrolase EC 3)
Ser-protease = proteasen dat serine bevatten als
katalytisch AZ (proteasen knippen eiwitten)
Principe: covalente katalyse
serine verliest H op OH en wordt nucleofiel dat zo
covalente binding kan aangaan met het substraat
en een covalent intermediair vormt
Krijgt ook samenwerking met histidine en
aspartaat, ASP helpt HIS de H+ van SER pakken
Subtilisine (bacterieel, BioTrix) en chymotrypsine
(menselijk) hebben zelfde ‘triade’ ontwikkeld
Redoxreacties onafh van elkaar, omdat het zo efficiënt werkt
-----------------------------
Voor redoxreacties elektronen makkelijk opgenomen/afgestaan kunnen worden → geen enkele van de 20 AZ komt hiervoor in aanmerking
→ cofactoren nodig, 2 soorten:
Metaalion = nodig voor binding of katalyse (Fe2/3+, Mg2+, Zn2+)
Co-enzym = organische molecule als cofactor
o Prostetische groep = blijft permanent zitten in het actief centrum
o Co-substraat = kan terug loskomen
Apo-enzym = enzym dat een cofactor nodig heeft
Holo-enzym = apo-enzym + cofactor
-----------------------------
Kunnen via cofactoren dus efficiënt elektronen doorsluizen naar substraat en omgekeerd
,Metaalkatalyse
Enzym zal het substraat tijdelijk stabiliseren door er een H+
tegen te plakken, of een metaalion (2 waardig + dus sterker
en niet gevoelig aan pH) doordat een negatieve lading ontstaat → elektrostatische stabilisatie (door “super acid” = enzym)
Case study 1: ser-protrase
Double displacement (verder op case-study ser-protease zie terug bij covalente katalyse
Zo genoemd omdat er 2 nucleofiele aanvallen achter elkaar gebeuren (eerst door serine, dan door water)
De zuur-base reactie door histidine vormt de motor voor de dubbele nucleofiele aanvallen van het double displacement
Histidine onttrekt proton van serine met behulp van aspartaat (helpt zuur-base reactie) = katalytische triade
Serine residue van enzyme valt substraat aan en bindt covalent (covalente katalyse, verankerd het substraat) (nucleofiel)
Histidine onttrekt dan een proton van water, dat water kan dan aanvallen (protease doet hydrolyse EC 3)
Serine pakt H+ van histidine terug
Tijdens krijg je dus twee intermediairen met negatieve ladingen → moeten gestabiliseerd worden om de TS te stabiliseren
Dit wordt in een bepaalde zone in het actief centrum gedaan = oxyanion hole → stabiliseer O- door vorming van H-vruggen
(zeker niet in elk enzym!)
S1-pocket bepaald specificiteit
Binnen het actief centrum zitten er subsites dat
individuele monomeren herkennen
(eiwitketen met AZ (P) enzym met pockets (S))
Nummeringssysteem pockets
▪ P en S nummeren vanaf waar het proteïne gesplitst zal worden (protease = hydrolase dat eiwit splitst via water)
▪ Naar links gewoon, naar rechts via accentje
▪ S1-subsite is in het geval van ser-proteasen veel belangrijker want daar gebeurt de discriminatie, het enzym zal pas beginnen
knippen na juiste AZ (P1 of P1’) daar respectievelijk in de S1 of S1’ pocket bindt → bepaald specificiteit
In geval van trypsine (vormt S1) als subunit zit daar een negatieve lading want trypsine is negatief geladen, zal dus pas knippen wanneer
juiste complementaire (voorwaarde enzym-substraat binding: ladingsverdeling) positief geladen AZ passeerd (arginine of lysine)
In geval van chemotrypsine als S1 (neutraal): heeft geen echte lading dus minder specifiek want wil iets groots neutraal binden →
verschillende mogelijkheden bv fenylalanine
,Case-study 2: glycosidasen (hydrolase EC 3.2)
▪ Glycosidasen = splitsen suikerbindingen (hydrolase) met behulp van water (lysozyme, amylase, cellulase, …)
veelvuldig ingezet in wasproducten, textielbehandeling en voor vrijmaken van bio-energie uit biomassa
In de natuur komen twee hoofdvormen van hydrolyse (aanval H2O) voor, afhankelijk van de ruimtelijke configuratie van het eindproduct
Sommige hydrolasen kunnen beide doen, sommige maar 1 (zoals ser-protease)
▪ Double displacement (energie besparen hiermee om binding in andere om te zetten)
o In context van glycosidasen betekent het retention = behoud van de oorspronkelijke stereochemische configuratie door
dubbele inversie
o Gebeurt in 2 stappen: zuur-base katalyse + covalente katalyse
o Soortgelijk aan die van ser-proteasen maar een verschil
▪ Gebeurt nu niet meer via katalytische triade: serine – histidine – arginine
▪ Nu 2 andere AZ die een carboxylgroep (zuur) hebben in hun zijketen: aspartaat en glutamaat
Kan 2 keer zelfde of een van elk zijn)
▪ Single displacement
o In de context van glycosidasen betekent het inversie = omkering van stereochemie
o Verloopt in 1 stap waarbij water direct aanvalt → configuratie klapt om (inversie)
o AZ zal nu niet aanvallen op substraat voor covalente binding te vormen
o Slechts ¼ glycosidasen doet het op deze manier, niet zo efficiënt
Manieren om TS te verlagen
▪ TS verlagen door binding en stabilisatie door enzym
▪ Grondtoestand verlagen vna het substraat = substraatdistortie → typisch voor glycosidasen
Subsites van actief centrum
▪ Opnieuw subsites dat zullen discrimineren en voor de specificeit zorgen zoals bij ser-proteasen
▪ Nummering nu wel anders: alles naar links minteken, rechts plusteken
3. Kinetiek
Michaelis-Menten kinetiek: enzymverzadiging
E en S moeten eerst associëren tot een ES-complex voordat het product P gevormd kan worden, anders geen katalyse
De snelheid van de reactie is afhankelijk van [ES] ipv [S] want limiterende factor wanneer alle enzymen bezet zijn (verzadiging)
als alle enzymen bezet zijn → [ES]max → Vmax
Pre-steady state (ms) = fractie van een
seconde waarin [ES] complex nog wordt opgebouwd
Steady state = Michaelis-Menten kinetiek meet vanaf
hier: vorming en afbraak van [ES] is in evenwicht
Hoe definieer je reactiesnelheid
▪ Toename in productconcentratie [P] naar de tijd
▪ Bij kinetiek focussen we op de initiële reactiesnelheid V0 (waar het bijna recht omhoog gaat in het begin)
→ hoe hoger startconcentratie [S] is, hoe sneller de reactie kan doorgaan = 1ste orde reactie: 𝐕 = 𝐤 ∙ [𝐒]
→ snelheid rechtevenredig met substraatconcentratie en relatie tss beide = evenredigheidsconstante = k = snelheidsconstante
,Rare bij enzymen: de evenredigheid (k) blijft niet gelden in verloop van tijd (lineaire stuk) chemie blijven moleculen botsen
Reden? → omdat we niet in een oplossing werken (chemie) maar in een actief centrum
▪ Opeens zijn alle enzymen bezet, dus [ES] stijgt niet meer, ook al verhoog je [S]
▪ Gaat naar plateau = enzymverzadiging → alle enzymen bezet → Vmax op dat moment = maximale reactiesnelheid
substraat moet dan wachten tot een enzym weer vrijkomt, we gaan van
eerste orde (V afh van [S]) naar nulde-orde reactie (snelheid constant)
Michaelis-constante KM = [S] waarbij je de helft van Vmax bereikt
het geeft de affiniteit van het enzym voor S weer
Michaelis-Menten parameters
▪ Steady-state principe
o Fase waarin [ES] = enzymsubstraatcomplex constant blijft
o Afbraak en opbouw ervan zijn in evenwicht: k1[E][S] = (k-1 + k2)[ES]
o [E] = [E]0 – [ES] = aantal vrije enzymen
▪ KM = Michaelis-constante [M]
o Vertelt iets over stabiliteit van ES-complex
o Manieren om ES-complex af te breken (k2 + k-1) op manier om het te vormen (k)
o Maat voor affiniteit, hoe lager KM, hoe hoger affiniteit tussen substraat en enzym
𝑘
o Als k2 << k-1 is 𝐾𝑀 = −1 = 𝑲𝑫 = echte maat voor affiniteit (reactie k1)
𝑘1
▪ Vmax = maximale snelheid
o Dit wordt berekent als de snelheid waarbij alle beschikbare enzymen ([E]0)
verzadigd zijn met substraat en in de ES-vorm zitten
o Bepaald dus maximale snelheid bij plateau, maar de hoogte van het plateau (waarde Vmax) wordt bepaald door
de enzymconcentratie [E]0 want hoe meer enzym, hoe meer er bezet kan worden voor naar plateau vorm over te gaan
→ Vmax zegt dus niet veel want kan beide experiment doen en bv 5x hogere Vmax krijgen (zelfde k, 5x hogere [E])
→ daarom deze waarde normaliseren door te delen door [E] → kcat
▪ Kcat = katalytische constante [s-1]
o De maximale turnover per E, het beschrijft enkel k2
o Hoe hoger kcat, hoe sneller het enzym de reactie zal katalyseren ([ES] → [E] + [P])
𝐤 𝐜𝐚𝐭
▪ = specificiteitsconstante
𝐊 𝐌
o Je kan hoge kcat met lage KM hebben, omgekeerd, of iets tussenin
o Specificiteitsconstante geeft globale efficiëntie weer
o Als k2 >> k-1 zeer hoog wordt, enkel k1 over → constante enkel door k1 bepaald = aan diffusiesnelhei
= diffusielimiet (deze grens wordt gezet op 108 M-1s-1)
→ enzymen die hiernaar streven (k2 >> k-1) = katalytisch perfecte enzymen (niet veel)
Invloed pH en temperatuur T
Elk enzym heeft optimum voor pH en T waarbij het maximale activiteit vertoont
▪ Invloed op activiteit → korte termijn (V0, kcat/KM)
▪ Invloed op stabiliteit → lange termijn (productie)
, Bepalen van de parameters
▪ [S] meestal 1 mM → varieert rond KM maar moet eerst al KM weten → moeilijk
▪ [E] meestal 1 µm → afhankelijk van kcat maar moet eerst al kcat weten → moeilijk
Kan via linearisatie ze bepalen maar groot probleem → foutmarges lopen op en rechtste punten op grafiek krijgen groter gewicht, maar
deze hebben wel een grotere foutenmarge → niet doen
Via de activiteit [U = units]
Activiteit [U] = totale hoeveelheid substraat die per tijdseenheid wordt omgezet in product door een enzym
o De activiteit zegt iets over de totale activiteit dat je in handen hebt met je enzym, niet over hoe ‘rap’ enzym is
o U in units = vrijstelling van 1 µmol product per min onder substraatcondities (opgelet µmol ipv mollair M bij [E] en [S])
Specifieke activiteit [U/mg] = maat voor de zuiverheid van het enzym, hoeveel wordt omgezet per mg eiwit
o Je wil in een mengsel dus een zuiver eiwit (je enzym van interesse hebben)
o Daartoe zal je zuiveringsproces doen
▪ Totale activiteit daalt → je verliest een beetje enzym
▪ Specifieke activiteit zal stijgen →vervuimende andere eiwitten weg
Inhibitie
Inhibitie van een enzym kan een groot probleem zijn voor biokatalyse
▪ Irreversibele-inhibitie = gaat sterke covalente binding aan met actief centrum → enzym permanent uitgeschakeld
o Chemische reagentia
▪ Reageren met specifieke functionele groepen van AZ, ongeacht of ze zich in het actief
centrum of niet van het enzym bevinden → dus aspecifiek
o Affiniteitslabel (S-analoog)
▪ Lijkt qua strucutur op het natuurlijke substraat → gaat specifiek naar actief centrum
▪ Eenmaal dar zal reactieve groep op het label het covalent vastzetten in het actief centrum
o Suicide inhibitor (zelfmoord-remmer)
▪ Inhib itor in eerste instantie onschadelijk, het wordt herkent door het enzym als substraat en begint een
katalytische reactie erop
▪ Door reactie wordt suicide inhibitor reactief en zal covalent binden en enzym uitschakelen = ‘zelfmoord”
▪ Reversibele inhibitie = tijdelijke associatie van enzym met ligand → gaan we veel voorhebben
o Allostrisch = niet-competitief [Km =, Vmax ↓]
▪ Molecule bindt op andere plaats dan in het actief centrum, geen competitie met substraat
▪ Kan gewoon binden aan E of aan ES
o Uncompetitief [Km ↓, Vmax ↓]
▪ Bindt enkel aan ES en stopt zo de katalytische reactie
o Competitief → meest voorkomend [Km ↑, Vmax =]
▪ Bindt enkel aan vrij enzym en zal binden in het katalytisch centrum
▪ Dit treedt op wanneer inhibitor een gelijkenis vertoont met S = substraatinhibitie, TS of P = productinhibitie
Gegeven door Prof. dr. Tom Desmet
HOOFDSTUK I: Intro
1. Definities
Biokatalyse en enzymtechnologie = gebruik van enzymen om chemische reacties te katalyseren chemische katalysatoren
→ geeft economisch en ecologisch voordeel
Biokatalyse = gebruik maken van bepaald enzym om precursor in 1 stap in product om te zetten
Biotransformatie = enzym in cel laten zitten om in 1 stap product te krijgen (bv stabieler)
wel niet heek het cel metabolisme gebruikt = whole cel biotransformation
Fermentatie = werken met intacte cel dat op voedingsbodem leeft en in #stappen product krijgt
2. Geschiedenis
Het toepassen en gebruiken van enzymen liep voor op de kennis
Bv maken van wijn, kaas, …
Wouden melk opslaan in magen van kalven → zit stremsel (rennet nu) in = complex van spijsverteringsenzymen
In het stremsel zit chemosine dat moedermelkeiwitten (caseïne) afbreekt
Krijgt klonering van melkeiwit (wrongel) dat kaas geef
▪ Pakte extract uit gerst om de hydrolyse van gerst
beter te begrijpen
▪ Voegde hier meel-extract aan toe bv en zag dat de ▪ Lock-key hypothese = sleutel slot
afbraak sneller verliep ▪ Hypothese dat elk enzym een affectiviteit heeft
▪ Extract kreeg naam diastase = cocktail van voor 1 substraat → halve eeuw later bevestigd al
amylasen (zetmeel afbreken) komt induced fit er ook bij
Payer – diastase Fischer
Buchner – zymase
▪ Wil aantonen dat je biologie wel kan zien als
aaneenschakelijk van chemische reacties
▪ Dood cellen af en haalt enzymatische werking eruit →
kon fermentatie nabootsen met het extract zonder
levenskracht nodig te hebben vis vitilis
▪ Zijn extract = zymase = gistextract Cel-extract = inhoud van de cel
Vanaf de 20ste eeuw begint de industriële toepassing van enzymen
Diastase (gist-extract) voor alcohol en bakken → graan afbreken tot vergistbare suikers → CO2↑ + ethanol↑
Rennet voor de bereiding van kaas, vroeger uit magen bij slagers geëxtraheerd
Oropon → protease voor de bereiding van leer, vroeger uit uitwerpselen van honden (pancreas enzym)
o Komt uit pancreas maar probleem in de tijd, pancreas ook nodig voor insuline
o Gingen opzoek naar microb iële enzymen voor Operon uit dier → subtilisine als microbiële vervanger gevoden
BioTex = wasmiddel met enzym subtilisine
o Gebruikt voor bereiding van leder maar ook in waspoeder
o Is een microbieel protease
o Was revolutionair voor overschakeling op microbiële enzymen
o Novo was eerste en nogsteeds markleider (70% van industriële enzymen, nu Novozyme)
,3. Voordelen enzymen
▪ Ze zijn selectief
o Chemo-selectief → zullen maar 1 bepaalde reactie katalyseren ≠ geen nevenreacties (zie later)
o Regio-selectief → als er 2 hydrolyseerbare regio’s zijn op een substraat zullen ze er maar 1 hydrolyseren chemie
o Enantio-selectief → kunnen onderscheidt maken tussen optische isomeren (D/L) zeer grote uitdaging voor chemie
van groot belang in de farmacie en geneeskunde
▪ Katalyseren bij milde reactiecondities (pH 7 en 30°C) → aanpasbaarheid via type enzym uit bepaald MO
▪ Zijn biodegradeerbaar toxisch
▪ Zeer efficiënt (108)
4. Vooroordelen enzymen
Naast de voordelen dat enzymen met zich meebrengen zijn chemici ook skeptisch en hebben ze vooroordelen voor het gebruik ervan
▪ Enzymen zijn duur
▪ Enzymen zijn onstabiel → kunnen denatureren (eiwit) met juist gebruik maanden hergebruiken
▪ Slechts 500 commercieel beschikbaar → van de gekende 5000 enzymsoorten zijn, vormt echter geen limitatie
bestelt gewoon gen dat het enzym codeert en maakt het zelf
▪ Kunnen enkel natuurlijk substraten binden → kan ze engineeren om synthetische substraten te binden
▪ Vereisen soms rare en dure cofactoren → regeneratie of biotransformatie gebruiken (cofactoren aanwezig in de cel)
5. Markt en toepassingen
27% voedsel → eten lekkerder maken bv
37% detergent → waspoeders, wasmiddelen, niet uitgebreid in cursus
8% andere → uitgebreid in cursus, om welbepaalde moleculen te maken, extraheren
en te gebruiken, vormt dus grootste wetenschappelijke uitdaging (bulk specifiek)
Enkele zaken uitgepikt
▪ Detergent: cellulase om losse vezels af te knippen aan oppervlakte van kledij (pluisjes)
▪ Voedsel: protease om zacht vlees te maken → indianen in Amazonewoud deden dit al: vlees in papaya-extract weken (uit plant!)
▪ Voedsel: galactosidase om lactose te hydrolyseren in melk, dus voor voorbehandeling melk om te verteren (Afrika, Azië)
▪ Voedsel: xylose isomerase voor de bereiding van High-fructose corn syrop (HFCS), nieuwe afzetmarkt VS om teveel aan mais te
verwerken: zetmeel → glucose → fructose → sucrose (HFCS) ≈ tafelzoet, gebruikt om frisdranken te zoeten (VS cola Europa)
▪ Voedsel: lipasen voor modificatie lipiden → productie margarine (smeerbare boter op kamer T), of fake chocolade (cacao te duur)
▪ Veevoeder: enzymen om voer al wat af te breken en zo beter verteerbaar te maken
▪ Textiel: cellulasen om witte strepen in denim te krijgen, vroeger met keien gewassen
▪ Chemie en geneeskunde: cursus vooral hieromtrent ‘other’, bv penicillinase dat penicilline afbreekt als patiënt allergisch is,
productie antibiotica, acrylamide, bioethanol, ….
Enzymen worden op heel grote schaal toegepast want worden voor zeer diverse doeleinden en producten gebruikt
▪ 25% producten via whole cel biotransformation
▪ 50% producten via immobilisatie
HOOFDSTUK II: Characterisation (hoe werkt enzym + uitleg praktische uitwerking)
1. Classificatie
Enzymen kunnen op 3 niveaus ingedeeld worden
▪ Obv sequentie = protein families = Pfam
▪ Obv structuur = 4 SCOP-klassen
▪ Obv reactie = 6 EC-klassen
,Protein families (Pfam)
Onderverdeling van enzymen obv hun sequentie in protein families
Zegt echter wel niets over structuur en functie
kan wel met enige zekerheid zeggen dat functie en structuur van 2 enzymen zelfde is als sequenties voor > 25% op elkaar lijken
Maar kan hierdoor wel verkeerd indelen → achteraf indelen in superfamilies = clans om die fouten recht te zetten
SCOP-classificatie
Groeperen van enzymen obv hun structuur: 𝛼-helix, β-vouwblad, …
Een specifieke groep eruit gehaald: (𝛃/𝛂)-TIM barrel
Deze structuur komt heel vaak voor (10% alle enzymen)
Naam afgeleid van triose fosfaat isomerase
→ eerste waarin structuur ontdekt is (belang in eiwit-glycosylatie)
Is een symmetrische molecule met telkens een 𝛼-helix, β-vouwblad
afgewisseld en dit 8 keer → (𝛃/𝛂)8 = TIM-barrel
Deze liggen opgerold in 2 lagen (cirkels) met β aan de binnenkant
Belangrijk: functionaliteit bij TIM-barrel wordt niet bepaald door de
structuur zelf want deze komt voor in verschillende families, maar wordt
bepaald door de lusstructuren + binnenste niet hol maar opgevuld met AZ residues
Enzyme Commision (EC) classificatie
Classificatie van enzymen obv de reactie die ze katalyseren
Classificatie bestaat uit 6 klassen met 3 subniveaus: subklasse – subsubklasse – reactie (bv EC 2.2.1.2)
probleem is dat sommige enzymen meerdere reacties katalyseren
EC 1 Oxidoreductasen redoxreacties katalyseren (dehydrogenasen, …)
EC 2 Transferasen functionele groep van 1 substraat naar ander transfereren, ATP nodig
EC 3 Hydrolasen splitsen binding met behulp van water (proteasen, lipasen, …)
EC 4 Lyasen splitsen binding zonder water via eliminatiereactie (dehydratasen, aldolasen, …)
EC 5 Isomerasen zet 2 isomeren om in elkaar → soort transferasen maar nu op zelfde substraat
EC 6 Ligasen gaan binding maken en hebben daarvoor ATP nodig → vorming energierijke bindingen
Merk op: verschil gebruik ATP bij 2/6 → (2) gebruiken ATP vaak als substraat, (6) doet niets met fosfaatgroep, ATP puur als E-bron
2. Mechanisme
Enzym werkt eigenlijk zoals een chemische katalysator
Enige verschil is in feite dat het efficiënter is → Reden? → omdat reactie doorgaat in een actief centrum = katalytisch centrum
Actief centrum = soort afgeschermde micro-omgeving waar andere omstandigheden kunnen gelden
(bv zure hydrolyse in een neutraal milieu bij chemie moet je het milieu eerst zuur maken)
Hierdoor efficiënt, milde condities realiseerbaar, specifiek (chemo-, regio-, stereo-)
én reguleerbaar: inhibitie en activatie
,Specificiteit van enzymen
Enzymen binden specifiek aan 1 (of soms meerdere) substraten via complementariteit tussen beide, 2 methodes
▪ Sleutel/slot = actief centrum rigide en statisch, substraat klikt er als het ware in (Fisher)
▪ Induced fit = bewegende loops, actief centrum is dynamischer in werkelijkheid
o Vroeger door persoon al als hypothese gesteld: hoe kunnen transferasen
vermijden dat bij verplaatsen van een fucntionele groep naar een ander
substraat in waterige omgeving, water de verplaatste groep niet pakt?
o = concept induced fit: actief centrum ‘omarmt’ substraat en pas dan krijg
je katalisatie → vermijdt zo hydrolyse
Belangrijk! Vorm substraat en katalytisch centrum is eigenlijk niet het belangrijkste
Wel → substraat moet complementair zijn met actief centrum obv ladingsverdeling
Dus eerder: secundaire interacties moeten perfect complementair zijn tussen beide (hydrofobe-, H-bruggen, VDW-interacties)
Basis van de katalyse (hoe het werkt en katalytische werking van enzym)
Basis van de katalyse: stabilisatie transitietoestand, verhoging aantal productieve botsingen en actieve uitwisselingen van H en of e-
Stabilisatie transitietoestand
▪ Enzymen verhogen de reactiesnelheid door de activatie-energie Ea te verlagen
o Ze spelen in op de kinetiek (k) maar niet op het evenwicht (K)!
2 belangrijke zaken die uit elkaar gehaald moeten worden
Thermodynamica = willen reageren Kinetiek = kunnen reageren
Alles streeft naar zo laag mogelijke E (2de wet TD) Gaat dus over snelheden en hoe rap we het evenwicht K bereiken, kan
P + Q lagere E-inhoud dan A + B → willen reageren wel op ingespeeld worden (k veranderen)
A+B→P+Q
∆G bepaald hoe graag ze dat willen, hoe lager, hoe Bij de vorming van een product moet een transitietoestand overwonnen
harder de reactie naar rechts ligt, hoe groter het worden = oude bindingen nog niet volledig verbroken, nieuwe nog niet
energieverschil is → bepaald uiteindelijk grote K volledig gevormd = twijfelmoment van naar welke kant ga ik →
afhankelijk van een gegeven temperatuur en de stressmomentje → energiepiek
chemische aard van de stoffen Hoe hoger de berg = activeringsenergie Ea, hoe moeilijker ze kunnen
Belangrijk: er kan niets aan K veranderd worden, reageren → bepaald door kleine k → kunnen hierop inspelen (energie
heeft te maken met structuur P en S, is en blijft zo. naar beneden halen, makkelijker over of terug) → enzym doet dit
Katalyse gaat hier dus niet over, gaat over Veranderd dus niets aan het evenwicht, gewoon hoe gemakkelijk of snel
snelheden en hoe gemakkelijk of snel we tot het je tot het evenwicht K geraakt
evenwicht K geraken (over berg = Ea) Stelling ‘ik heb een ander enzym gevonden dat een hoger rendement
geeft voor die reactie’ → kan niet want is bepaald door thermodynamica
Kan in principe wel als het ene nevenreacties krijgt of bij hogere
temperatuur, maar gaat niet over thermodynamische aard
,Enzymen zullen de transitietoestand verlagen wanneer het enzym perfect complementair is met de transitietoestand
sommige enzymen zullen ook de grondtoestand van het substraat exciteren om ook zo de berg te verlagen = substraat distortie
Theoretisch concept: ABenzymen (jaren 80 idee)
Kunnen we een enzym omschrijven als: een eiwit dat in staat is om heel sterk (hoge affiniteit) een transitietoestand (TS) te binden
Zou willen zeggen dat als we antilichamen (eiwit) creëren dat heel goed met de TS kan reageren we een enzym maken
Dan zouden we voor om het even welke reactie een enzym kunnen creëren = ABenzymen = katalytische antilichamen
Blijkt praktisch niet mogelijk, TS valt niet te isoleren, hoogstens te detecteren + enzym blijkt complexer te zijn dan die definitie
Verhoging aantal productieve botsingen
Enzymen binden en stabiliseren niet enkel de transitietoestand, maar er is ook nog de botsingstheorie
Twee moleculen kunnen pas interageren als met elkaar ontmoeten en met de juiste oriëntatie botsen
→ dus niet elke botsing zal effectief zijn, oriëntatie ook van belang
Gekarakteriseerd door Arhenus vergelijking → enzym speelt op alle componenten in
▪ Z = totaal aantal botsingen (proximiteit)
o Zal Z verhogen (bv 2 substraten of 1tje isoleren in actief centrum → zullen meer botsen)
▪ p = procent aantal botsingen met juiste oriëntatie (oriëntatie)
o p factor is 100¨% want enzym zo ‘ontworpen’ om juiste oriëntatie te hebben
▪ e ^-Ea/RT
= fractie van de botsingen met juiste oriëntatie dat genoeg energie heeft om over de transitietoestand te raken
o Wordt verlaagt want activeringsenergie daalt door binding en stabilisatie van TS → grootste effect (negatieve macht)
Actieve uitwisselingen van H en of e-
Naast verlagen van Ea en dus versnellen van de reactie + verhoging van het aantal productieve botsingen,
neemt het enzym ook actief deel aan de reactie, is niet gewoon TS binden en stabiliseren, zit daar niet gewoon te katalyseren
→ gaat elektronen (e- ) en protonen (H+) uitwisselen met substraat om reactie nog efficiënter te maken
▪ Zuur/base katalyse uitwisseling H+ hydrolasen (EC 3)
▪ Covalente katalyse delen e- hydrolasen (EC 3)
▪ Redox katalyse overdracht e- oxidoreductasen (EC 1)
▪ Metaalkatalyse
,Zuur-base katalyse
-----------------------------
Reactiviteit van aminozuren
belangrijk voor zuur-base reacties, de protonen en elektronen dat enzym uitwisselt (eiwit uit AZ gebouwd) zijn afkomstig van functionele
groepen = de zijkentens, enkel volgende AZ zijn hier toe instaat van de 20 #AZ
▪ Zure AZ → H+ uitwisselen aspartaat, glutamaat
▪ Basische AZ (dragen N) → H+ opnemen lysine, arginine
▪ Hystidine → kan basisch optreden maar niet zo sterk, zal opgenomen H+ vaak direct terug afgeven
o Proton shuttle mechanisme van histidine
o Belangrijkste katalytische AZ, kan makkelijk wisselen tussen geprotoneerde en gedeprotoneerde toestand
o Fungeert dus zo als perfecte zuur-base katalysator die protonen verplaatst (shuttle)
▪ Serine → heeft hydroxylgroep als zijketen (R = OH) is van zichzelf niet echt
reactief maar wel in bijzijn van histidine of aspartaat = katalytische triade
o Vanaf het zijn H verliest → sterk nucleofiel → kan covalente
binding aangaan met substraten (zie covalente katalyse)
-----------------------------
Zuur-base katalyse met enzymen: enzymen kunnen beide tegelijk doen (zuur en basereactie) door micro-omgeving
Zijketens met geschikte AZ nu gebruikt voor de katalytische reactie (uitwisseling H+)
Covalente katalyse
Soms splitsen enzymen reacties op in 2 delen, en gaan tussentijds het substraat
veranker dmv een covalente binding (naast secundaire interacties voor aantrekking)
Het covalent intermediar is entropisch gunstiger
Case-study: serine-protease (hydrolase EC 3)
Ser-protease = proteasen dat serine bevatten als
katalytisch AZ (proteasen knippen eiwitten)
Principe: covalente katalyse
serine verliest H op OH en wordt nucleofiel dat zo
covalente binding kan aangaan met het substraat
en een covalent intermediair vormt
Krijgt ook samenwerking met histidine en
aspartaat, ASP helpt HIS de H+ van SER pakken
Subtilisine (bacterieel, BioTrix) en chymotrypsine
(menselijk) hebben zelfde ‘triade’ ontwikkeld
Redoxreacties onafh van elkaar, omdat het zo efficiënt werkt
-----------------------------
Voor redoxreacties elektronen makkelijk opgenomen/afgestaan kunnen worden → geen enkele van de 20 AZ komt hiervoor in aanmerking
→ cofactoren nodig, 2 soorten:
Metaalion = nodig voor binding of katalyse (Fe2/3+, Mg2+, Zn2+)
Co-enzym = organische molecule als cofactor
o Prostetische groep = blijft permanent zitten in het actief centrum
o Co-substraat = kan terug loskomen
Apo-enzym = enzym dat een cofactor nodig heeft
Holo-enzym = apo-enzym + cofactor
-----------------------------
Kunnen via cofactoren dus efficiënt elektronen doorsluizen naar substraat en omgekeerd
,Metaalkatalyse
Enzym zal het substraat tijdelijk stabiliseren door er een H+
tegen te plakken, of een metaalion (2 waardig + dus sterker
en niet gevoelig aan pH) doordat een negatieve lading ontstaat → elektrostatische stabilisatie (door “super acid” = enzym)
Case study 1: ser-protrase
Double displacement (verder op case-study ser-protease zie terug bij covalente katalyse
Zo genoemd omdat er 2 nucleofiele aanvallen achter elkaar gebeuren (eerst door serine, dan door water)
De zuur-base reactie door histidine vormt de motor voor de dubbele nucleofiele aanvallen van het double displacement
Histidine onttrekt proton van serine met behulp van aspartaat (helpt zuur-base reactie) = katalytische triade
Serine residue van enzyme valt substraat aan en bindt covalent (covalente katalyse, verankerd het substraat) (nucleofiel)
Histidine onttrekt dan een proton van water, dat water kan dan aanvallen (protease doet hydrolyse EC 3)
Serine pakt H+ van histidine terug
Tijdens krijg je dus twee intermediairen met negatieve ladingen → moeten gestabiliseerd worden om de TS te stabiliseren
Dit wordt in een bepaalde zone in het actief centrum gedaan = oxyanion hole → stabiliseer O- door vorming van H-vruggen
(zeker niet in elk enzym!)
S1-pocket bepaald specificiteit
Binnen het actief centrum zitten er subsites dat
individuele monomeren herkennen
(eiwitketen met AZ (P) enzym met pockets (S))
Nummeringssysteem pockets
▪ P en S nummeren vanaf waar het proteïne gesplitst zal worden (protease = hydrolase dat eiwit splitst via water)
▪ Naar links gewoon, naar rechts via accentje
▪ S1-subsite is in het geval van ser-proteasen veel belangrijker want daar gebeurt de discriminatie, het enzym zal pas beginnen
knippen na juiste AZ (P1 of P1’) daar respectievelijk in de S1 of S1’ pocket bindt → bepaald specificiteit
In geval van trypsine (vormt S1) als subunit zit daar een negatieve lading want trypsine is negatief geladen, zal dus pas knippen wanneer
juiste complementaire (voorwaarde enzym-substraat binding: ladingsverdeling) positief geladen AZ passeerd (arginine of lysine)
In geval van chemotrypsine als S1 (neutraal): heeft geen echte lading dus minder specifiek want wil iets groots neutraal binden →
verschillende mogelijkheden bv fenylalanine
,Case-study 2: glycosidasen (hydrolase EC 3.2)
▪ Glycosidasen = splitsen suikerbindingen (hydrolase) met behulp van water (lysozyme, amylase, cellulase, …)
veelvuldig ingezet in wasproducten, textielbehandeling en voor vrijmaken van bio-energie uit biomassa
In de natuur komen twee hoofdvormen van hydrolyse (aanval H2O) voor, afhankelijk van de ruimtelijke configuratie van het eindproduct
Sommige hydrolasen kunnen beide doen, sommige maar 1 (zoals ser-protease)
▪ Double displacement (energie besparen hiermee om binding in andere om te zetten)
o In context van glycosidasen betekent het retention = behoud van de oorspronkelijke stereochemische configuratie door
dubbele inversie
o Gebeurt in 2 stappen: zuur-base katalyse + covalente katalyse
o Soortgelijk aan die van ser-proteasen maar een verschil
▪ Gebeurt nu niet meer via katalytische triade: serine – histidine – arginine
▪ Nu 2 andere AZ die een carboxylgroep (zuur) hebben in hun zijketen: aspartaat en glutamaat
Kan 2 keer zelfde of een van elk zijn)
▪ Single displacement
o In de context van glycosidasen betekent het inversie = omkering van stereochemie
o Verloopt in 1 stap waarbij water direct aanvalt → configuratie klapt om (inversie)
o AZ zal nu niet aanvallen op substraat voor covalente binding te vormen
o Slechts ¼ glycosidasen doet het op deze manier, niet zo efficiënt
Manieren om TS te verlagen
▪ TS verlagen door binding en stabilisatie door enzym
▪ Grondtoestand verlagen vna het substraat = substraatdistortie → typisch voor glycosidasen
Subsites van actief centrum
▪ Opnieuw subsites dat zullen discrimineren en voor de specificeit zorgen zoals bij ser-proteasen
▪ Nummering nu wel anders: alles naar links minteken, rechts plusteken
3. Kinetiek
Michaelis-Menten kinetiek: enzymverzadiging
E en S moeten eerst associëren tot een ES-complex voordat het product P gevormd kan worden, anders geen katalyse
De snelheid van de reactie is afhankelijk van [ES] ipv [S] want limiterende factor wanneer alle enzymen bezet zijn (verzadiging)
als alle enzymen bezet zijn → [ES]max → Vmax
Pre-steady state (ms) = fractie van een
seconde waarin [ES] complex nog wordt opgebouwd
Steady state = Michaelis-Menten kinetiek meet vanaf
hier: vorming en afbraak van [ES] is in evenwicht
Hoe definieer je reactiesnelheid
▪ Toename in productconcentratie [P] naar de tijd
▪ Bij kinetiek focussen we op de initiële reactiesnelheid V0 (waar het bijna recht omhoog gaat in het begin)
→ hoe hoger startconcentratie [S] is, hoe sneller de reactie kan doorgaan = 1ste orde reactie: 𝐕 = 𝐤 ∙ [𝐒]
→ snelheid rechtevenredig met substraatconcentratie en relatie tss beide = evenredigheidsconstante = k = snelheidsconstante
,Rare bij enzymen: de evenredigheid (k) blijft niet gelden in verloop van tijd (lineaire stuk) chemie blijven moleculen botsen
Reden? → omdat we niet in een oplossing werken (chemie) maar in een actief centrum
▪ Opeens zijn alle enzymen bezet, dus [ES] stijgt niet meer, ook al verhoog je [S]
▪ Gaat naar plateau = enzymverzadiging → alle enzymen bezet → Vmax op dat moment = maximale reactiesnelheid
substraat moet dan wachten tot een enzym weer vrijkomt, we gaan van
eerste orde (V afh van [S]) naar nulde-orde reactie (snelheid constant)
Michaelis-constante KM = [S] waarbij je de helft van Vmax bereikt
het geeft de affiniteit van het enzym voor S weer
Michaelis-Menten parameters
▪ Steady-state principe
o Fase waarin [ES] = enzymsubstraatcomplex constant blijft
o Afbraak en opbouw ervan zijn in evenwicht: k1[E][S] = (k-1 + k2)[ES]
o [E] = [E]0 – [ES] = aantal vrije enzymen
▪ KM = Michaelis-constante [M]
o Vertelt iets over stabiliteit van ES-complex
o Manieren om ES-complex af te breken (k2 + k-1) op manier om het te vormen (k)
o Maat voor affiniteit, hoe lager KM, hoe hoger affiniteit tussen substraat en enzym
𝑘
o Als k2 << k-1 is 𝐾𝑀 = −1 = 𝑲𝑫 = echte maat voor affiniteit (reactie k1)
𝑘1
▪ Vmax = maximale snelheid
o Dit wordt berekent als de snelheid waarbij alle beschikbare enzymen ([E]0)
verzadigd zijn met substraat en in de ES-vorm zitten
o Bepaald dus maximale snelheid bij plateau, maar de hoogte van het plateau (waarde Vmax) wordt bepaald door
de enzymconcentratie [E]0 want hoe meer enzym, hoe meer er bezet kan worden voor naar plateau vorm over te gaan
→ Vmax zegt dus niet veel want kan beide experiment doen en bv 5x hogere Vmax krijgen (zelfde k, 5x hogere [E])
→ daarom deze waarde normaliseren door te delen door [E] → kcat
▪ Kcat = katalytische constante [s-1]
o De maximale turnover per E, het beschrijft enkel k2
o Hoe hoger kcat, hoe sneller het enzym de reactie zal katalyseren ([ES] → [E] + [P])
𝐤 𝐜𝐚𝐭
▪ = specificiteitsconstante
𝐊 𝐌
o Je kan hoge kcat met lage KM hebben, omgekeerd, of iets tussenin
o Specificiteitsconstante geeft globale efficiëntie weer
o Als k2 >> k-1 zeer hoog wordt, enkel k1 over → constante enkel door k1 bepaald = aan diffusiesnelhei
= diffusielimiet (deze grens wordt gezet op 108 M-1s-1)
→ enzymen die hiernaar streven (k2 >> k-1) = katalytisch perfecte enzymen (niet veel)
Invloed pH en temperatuur T
Elk enzym heeft optimum voor pH en T waarbij het maximale activiteit vertoont
▪ Invloed op activiteit → korte termijn (V0, kcat/KM)
▪ Invloed op stabiliteit → lange termijn (productie)
, Bepalen van de parameters
▪ [S] meestal 1 mM → varieert rond KM maar moet eerst al KM weten → moeilijk
▪ [E] meestal 1 µm → afhankelijk van kcat maar moet eerst al kcat weten → moeilijk
Kan via linearisatie ze bepalen maar groot probleem → foutmarges lopen op en rechtste punten op grafiek krijgen groter gewicht, maar
deze hebben wel een grotere foutenmarge → niet doen
Via de activiteit [U = units]
Activiteit [U] = totale hoeveelheid substraat die per tijdseenheid wordt omgezet in product door een enzym
o De activiteit zegt iets over de totale activiteit dat je in handen hebt met je enzym, niet over hoe ‘rap’ enzym is
o U in units = vrijstelling van 1 µmol product per min onder substraatcondities (opgelet µmol ipv mollair M bij [E] en [S])
Specifieke activiteit [U/mg] = maat voor de zuiverheid van het enzym, hoeveel wordt omgezet per mg eiwit
o Je wil in een mengsel dus een zuiver eiwit (je enzym van interesse hebben)
o Daartoe zal je zuiveringsproces doen
▪ Totale activiteit daalt → je verliest een beetje enzym
▪ Specifieke activiteit zal stijgen →vervuimende andere eiwitten weg
Inhibitie
Inhibitie van een enzym kan een groot probleem zijn voor biokatalyse
▪ Irreversibele-inhibitie = gaat sterke covalente binding aan met actief centrum → enzym permanent uitgeschakeld
o Chemische reagentia
▪ Reageren met specifieke functionele groepen van AZ, ongeacht of ze zich in het actief
centrum of niet van het enzym bevinden → dus aspecifiek
o Affiniteitslabel (S-analoog)
▪ Lijkt qua strucutur op het natuurlijke substraat → gaat specifiek naar actief centrum
▪ Eenmaal dar zal reactieve groep op het label het covalent vastzetten in het actief centrum
o Suicide inhibitor (zelfmoord-remmer)
▪ Inhib itor in eerste instantie onschadelijk, het wordt herkent door het enzym als substraat en begint een
katalytische reactie erop
▪ Door reactie wordt suicide inhibitor reactief en zal covalent binden en enzym uitschakelen = ‘zelfmoord”
▪ Reversibele inhibitie = tijdelijke associatie van enzym met ligand → gaan we veel voorhebben
o Allostrisch = niet-competitief [Km =, Vmax ↓]
▪ Molecule bindt op andere plaats dan in het actief centrum, geen competitie met substraat
▪ Kan gewoon binden aan E of aan ES
o Uncompetitief [Km ↓, Vmax ↓]
▪ Bindt enkel aan ES en stopt zo de katalytische reactie
o Competitief → meest voorkomend [Km ↑, Vmax =]
▪ Bindt enkel aan vrij enzym en zal binden in het katalytisch centrum
▪ Dit treedt op wanneer inhibitor een gelijkenis vertoont met S = substraatinhibitie, TS of P = productinhibitie
