Samenvatting EcoRV

Bespreek ecoRV.
 Wat is het?

- Enzym, endonuclease, restrictie-enzym
- Primitief
- Beschermingsmechanisme van bacteriën en tegen virussen
- Werkt uiterst specifiek

 Wat doet het?

- Endonuclease: Knipt DNA binnenin de streng via hydrolyse van
fosfodiësterbinding.




- Restrictie-enzym: Herkent specifieke korte DNA-sequenties
(palindroomconfiguratie) en knipt het DNA precies op die plaatsen.
- Verlaagt AE via metaalion katalyse + benaderingskatalyse

 Hoe zorgen dat EcoRV enkel vreemd DNA knipt?




- Restrictie-enzym EcoRV-methylase
- Komt aan op 1 atoom bij de methylatie (methylgroep toevoegen).
- Methylgroep op de base van eigen DNA  Geen H-bruggen gevormd tussen
base en residuen van enzym (sterische hindering)  Basen niet meer
herkend  DNA wordt niet geknikt  Geen fosfaatgroep dicht genoeg bij
Mg2+  Niet dicht genoeg bij H2O  Geen hydrolyse
- Voor elk restrictie-enzym bestaat er een overeenstemmende methylase. Zo
een paar enzymen = restrictiemodificatiesysteem.




 Chemische reactie van poly-substituted phosphates

, - Inversie
 1 stap
 Directe hydrolyse
 Geen covalent intermediair
 H₂O voert rechtstreeks nucleofiele aanval uit op het fosfor, tegelijk
vertrekt andere groep.
 Resultaat: gespiegelde configuratie




- Retentie
 2 stappen
 Configuratie van chiraal centrum blijft behouden: Covalent fosforyl-
enzymintermediair
 4 substituenten (symmetrie)  Transitietoestand: intermediair met 5
substituenten (trigonale bipyramide).
 Concentratie van de substituenten verandert continu
 Resultaat: 2 inversies (1 bij elke aanval)  Netto retentie van de
oorspronkelijke configuratie.

Stap 1:

 De nucleofiele groep van enzym valt P aan.
 De vertrekkende groep van substraat verdwijnt.
 Configuratie rond fosfor keert om → 1ste inversie.
 Resultaat: Covalent gebonden fosforyl-enzymcomplex.




Stap 2:

 H2O valt nu het P van het covalente intermediair aan.
 Enzym wordt vrijgemaakt, H2O neemt de fosfaatgroep over.
 Dit zorgt opnieuw voor een inversie van configuratie.