TEMA 7: METODOS DE TRANSFORMACION
1. Transformación de plantas
El método más utilizado es el empleo de Agrobacterium tumefaciens como método
de transformación de plantas. Agrobacterium es una bacteria gram negativa (gram -)
del suelo que es capaz de infectar a las plantas en la interfase entre la parte área y la
raíz generando unos tumores conocidos como agallas de la corona. De manera
natural solo infecta a dicotiledóneas, las monocotiledóneas no producen la sustancia
que las atrae.
En el cromosoma de Agrobacterium se encuentran los genes chv, que son los genes
implicados en el movimiento quimiotáctico bacteriano y en la unión de la bacteria a
receptores específicos de la célula vegetal, es decir, intervienen en el reconocimiento
entre la bacteria y la planta. Tiene un plásmido que es Ti y se sabe que dentro de este
hay un fragmento de T-DNA que se transloca directamente desde la célula bacteriana
hasta el núcleo vegetal . La célula vegetal lo integra en su genoma y lo expresa, a
pesar de su origen procariota. Este plásmido contiene génesis para síntesis y
metabolización de opinas (aminoácidos que solo se producen en infección y sirven de
fuente de C y N). Además, pueden sintetizar auxinas y citoquininas. Es decir, este
plásmido posee prácticamente toda la información para descontrolar el
funcionamiento de la planta.
Además, tiene región Vir, que son de virulencia. Estos inducen la hipertrofia vegetal y
por ello se hubo que modificar.
En el cromosoma circular de Agrobacterium hay un grupo de genes, chv, que están
implicados en el movimiento quimiotáctico de la bacteria hacia la planta, ya que esta
última secreta una serie de compuestos fenólicos cuando se produce una herida en la
planta, generando un gradiente hacia el cual se dirige la bacteria, que a medida que
se mueve, va generando proteínas de reconocimiento de los receptores presentes en
la planta para la fijación de la bacteria. El tumor se inicia cuando la bacteria entra por
una lesión, generalmente en la corona (unión de la raíz al tallo al nivel del suelo) y se
pega a las células de la planta. Una bacteria virulenta lleva, además de su DNA
cromosómico, un plásmido Ti (inductor de tumores). Un fragmento del plásmido Ti, el T-
DNA, es introducido en una célula vegetal y se integra en el DNA cromosómico de ésta.
El TDNA lleva genes para la producción de auxinas, citoquininas y opinas. Las células
transformadas proliferan formando un tumor de agalla de la corona, gracias a su nueva
capacidad para producir hormonas y además producen opinas, la fuente vital de C y
N de la bacteria por lo que estas proliferan junto al tumor.
¿Por qué invade Agrobacterium las células vegetales? Agrobacterium incluye un
plásmido de gran tamaño con 200 kb denominado plásmido TI el cual es el responsable
de la patogenicidad, es decir, de la interacción de las células radiculares y su
introducción en las células vegetales. Esto depende de una secuencia del plásmido, el
t-DNA un fragmento de la secuencia del plásmido TI que se introduce en la célula
vegetal. Además, presentan secuencias que produces factores de virulencia, que no
solo ayudan a la patogenicidad, sino que son capaces de establecer un mecanismo
de transporte del t-DNA, establecen un canal de transferencia y además son secuencias
involucradas en la síntesis de opinas. Estas sustancias carbonatadas que Agrobacterium
requiere como nutrientes abastecen a la célula, es decir, usan estos compuestos como
sustrato metabólico, y además presentan otros factores de virulencia que producen
auxinas y citoquininas, hormonas naturales que producen las plantas que modifican el
patrón de desarrollo vegetal modifican el desarrollo de raíces y el desarrollo del ápice.
, Son fitohormonas relacionadas con el crecimiento y el desarrollo de ahí que se
produzcan los tumores de coronas que se produce por una desregulación de la auxina
y citoquinina en los tejidos por donde penetra Agrobacterium. Se ve un callo, conjunto
de células vegetales que se dividen masivamente pero que no se han diferenciado.
Para transformar con Agrobacterium se eliminan los genes de hormonas y opinas del
plásmido Ti y se introduce el gen de interés en la zona del T-DNA. Además, suele
incluirse un gen reporter (por ejemplo un gen de resistencia a antibiótico).
Para construir un vector de transformación mediada por Agrobacterium, se necesita
además:
1. Origen de replicación funcional en E. coli, como herramienta de trabajo para
aislar el ADN a gran escala.
2. Origen de replicación funcional en Agrobacterium, para multiplicarse en esta
bacteria y transferirlo a la planta.
3. Genes de resistencia a antibiótico capaces de expresarse en ambas bacterias
para seleccionar las cepas que contengan nuestro vector de transformación.
4. Región vir, esencial para la transferencia e integración del T-DNA en el genoma
de la célula vegetal.
5. T-DNA que solo conserve los bordes derecho e izquierdo para la integración
dentro del genoma de la planta. Multiclonic site: Pequeña secuencia con
múltiples dianas de enzimas de restricción.
• Transformación: del plásmido monoparental existe la alternativa de dividirlo en dos:
-Plásmido desarmado (monoparental), Ti desarmado: solo posee la información
para permitir la transferencia.
-Vector binario: Orígenes de compatibilidad con E. coli y con Agrobacterium, un
marcador (gen de resistencia a antibióticos por ejemplo); y el LB, RB y multiclonic site.
Es lo que se transfiere, ya que el vector binario es mucho más pequeño (10-15 kb).
1. Transformación de plantas
El método más utilizado es el empleo de Agrobacterium tumefaciens como método
de transformación de plantas. Agrobacterium es una bacteria gram negativa (gram -)
del suelo que es capaz de infectar a las plantas en la interfase entre la parte área y la
raíz generando unos tumores conocidos como agallas de la corona. De manera
natural solo infecta a dicotiledóneas, las monocotiledóneas no producen la sustancia
que las atrae.
En el cromosoma de Agrobacterium se encuentran los genes chv, que son los genes
implicados en el movimiento quimiotáctico bacteriano y en la unión de la bacteria a
receptores específicos de la célula vegetal, es decir, intervienen en el reconocimiento
entre la bacteria y la planta. Tiene un plásmido que es Ti y se sabe que dentro de este
hay un fragmento de T-DNA que se transloca directamente desde la célula bacteriana
hasta el núcleo vegetal . La célula vegetal lo integra en su genoma y lo expresa, a
pesar de su origen procariota. Este plásmido contiene génesis para síntesis y
metabolización de opinas (aminoácidos que solo se producen en infección y sirven de
fuente de C y N). Además, pueden sintetizar auxinas y citoquininas. Es decir, este
plásmido posee prácticamente toda la información para descontrolar el
funcionamiento de la planta.
Además, tiene región Vir, que son de virulencia. Estos inducen la hipertrofia vegetal y
por ello se hubo que modificar.
En el cromosoma circular de Agrobacterium hay un grupo de genes, chv, que están
implicados en el movimiento quimiotáctico de la bacteria hacia la planta, ya que esta
última secreta una serie de compuestos fenólicos cuando se produce una herida en la
planta, generando un gradiente hacia el cual se dirige la bacteria, que a medida que
se mueve, va generando proteínas de reconocimiento de los receptores presentes en
la planta para la fijación de la bacteria. El tumor se inicia cuando la bacteria entra por
una lesión, generalmente en la corona (unión de la raíz al tallo al nivel del suelo) y se
pega a las células de la planta. Una bacteria virulenta lleva, además de su DNA
cromosómico, un plásmido Ti (inductor de tumores). Un fragmento del plásmido Ti, el T-
DNA, es introducido en una célula vegetal y se integra en el DNA cromosómico de ésta.
El TDNA lleva genes para la producción de auxinas, citoquininas y opinas. Las células
transformadas proliferan formando un tumor de agalla de la corona, gracias a su nueva
capacidad para producir hormonas y además producen opinas, la fuente vital de C y
N de la bacteria por lo que estas proliferan junto al tumor.
¿Por qué invade Agrobacterium las células vegetales? Agrobacterium incluye un
plásmido de gran tamaño con 200 kb denominado plásmido TI el cual es el responsable
de la patogenicidad, es decir, de la interacción de las células radiculares y su
introducción en las células vegetales. Esto depende de una secuencia del plásmido, el
t-DNA un fragmento de la secuencia del plásmido TI que se introduce en la célula
vegetal. Además, presentan secuencias que produces factores de virulencia, que no
solo ayudan a la patogenicidad, sino que son capaces de establecer un mecanismo
de transporte del t-DNA, establecen un canal de transferencia y además son secuencias
involucradas en la síntesis de opinas. Estas sustancias carbonatadas que Agrobacterium
requiere como nutrientes abastecen a la célula, es decir, usan estos compuestos como
sustrato metabólico, y además presentan otros factores de virulencia que producen
auxinas y citoquininas, hormonas naturales que producen las plantas que modifican el
patrón de desarrollo vegetal modifican el desarrollo de raíces y el desarrollo del ápice.
, Son fitohormonas relacionadas con el crecimiento y el desarrollo de ahí que se
produzcan los tumores de coronas que se produce por una desregulación de la auxina
y citoquinina en los tejidos por donde penetra Agrobacterium. Se ve un callo, conjunto
de células vegetales que se dividen masivamente pero que no se han diferenciado.
Para transformar con Agrobacterium se eliminan los genes de hormonas y opinas del
plásmido Ti y se introduce el gen de interés en la zona del T-DNA. Además, suele
incluirse un gen reporter (por ejemplo un gen de resistencia a antibiótico).
Para construir un vector de transformación mediada por Agrobacterium, se necesita
además:
1. Origen de replicación funcional en E. coli, como herramienta de trabajo para
aislar el ADN a gran escala.
2. Origen de replicación funcional en Agrobacterium, para multiplicarse en esta
bacteria y transferirlo a la planta.
3. Genes de resistencia a antibiótico capaces de expresarse en ambas bacterias
para seleccionar las cepas que contengan nuestro vector de transformación.
4. Región vir, esencial para la transferencia e integración del T-DNA en el genoma
de la célula vegetal.
5. T-DNA que solo conserve los bordes derecho e izquierdo para la integración
dentro del genoma de la planta. Multiclonic site: Pequeña secuencia con
múltiples dianas de enzimas de restricción.
• Transformación: del plásmido monoparental existe la alternativa de dividirlo en dos:
-Plásmido desarmado (monoparental), Ti desarmado: solo posee la información
para permitir la transferencia.
-Vector binario: Orígenes de compatibilidad con E. coli y con Agrobacterium, un
marcador (gen de resistencia a antibióticos por ejemplo); y el LB, RB y multiclonic site.
Es lo que se transfiere, ya que el vector binario es mucho más pequeño (10-15 kb).
