Samenvatting - Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (B-KUL-E0F94A)

Methoden in het biomedisch onderzoek - 2
H2. Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
Breed gamma aan vraagstellingen (focus op de mens)

 Fysiologische vraagstelling -> hoe werkt ons lichaam
 Pathologische vraagstelling -> wat loopt er fout -> maatschappelijk belang

Niveaus: Organisme – weefsel – cel – subcellulair (combinatie)
Vormen van onderzoek:

 Open exploratief onderzoek
 Versch experimenten gebr zonder specifieke richting te kiezen
 Zorgt dat we hypothese kunnen genereren
 Hypothese gedreven onderzoek
 Specifieke exp met hypothese (antwoord vooropstellen)

Soorten onderzoek:

 Fundamenteel: Analyse moleculaire bestanddelen/processen in cel
 Translationeel: overgang
 Klinisch:
 Patiënt-gericht
o Optimaliseren diagnose / verbeteren behandeling / nieuw geneesmiddel
 PICO principe (patiënt – intervention – controls – outcome)
 Fasen
1. Gezonde personen
2. Beperkte groep zieke personen
3. Grotere groep
4. Op de markt -> langetermijneffecten

Analyse:

 In vivo: levende organismen
 Ex vivo: stalen v organismen (representeerd lichaam)
 In vitro: proefbuis
 In silico: met computer

Definities

 Precisie (variabiliteit)
 maat vr reproduceerbaarheid
 standaard deviatie – coëfficiënt v variatie
 Accuraatheid
 Verschil gemeten waarde – echte waarde
 Populatiestatistiek (confidentieniveau)
 Detectielimiet (gevoeligheid) -> kleinste gemeten waarde
 Kwantificatielimiet
 Kleinste waarde met voldoende nauwkeurigheid
 Robuustheid
 Maat vr consistent resultaat ondanks klein verschil in experimentele parameters

1

,Criteria vr selectie van methoden: variabelen, precisie, detectielimiet, stalen, apparatuur,
vergunningen, …

H4. Eiwitten
Isoleren van eiwitten

Algemeen

 Startmateriaal: weefsel, bloed, cellen, organellen
 Homogenisatie (detergent, invries-ontdooien, sonicatie, …)
 Ruw eiwitlysaat => opzuiveren: chromotografie / elektroforese

Homogenisatiebuffer: (eiwitten goed bewaard houden)

 Buffer -> pH ~ lading eiwit
 Zout (weinig) -> voorkomt denaturatie
 Protease inhibitoren -> voorkomt afbraak => vaak mengsel meerdere inhibitoren
 Serine proteasen (trysine, chymotrypsine, thrombine, kallikreïne)
o Inhibitoren: PMSF, benzamidine (BZA), aprotinine
 Metalloproteasen (metaalion nodig)
o Inhibitoren: EDTA (bindt bivalente kationen)
 Soms weglaten: goede enzymen soms ook metaalionen nodig
 Cysteïne / thiol proteasen
o Inhibitoren: leupeptine (bindt cysteïne)
 Aspartaat proteasen (pepsine, renine, cathepsine)
o Inhibitoren: papstatine (bindt aspartaat)
 (Fosfatase inhibitoren) -> behouden van fosforylaties => vaak mengsel inhibitoren
 Serine/threonine fosfatasen
o Inhibitoren: natrium fluoride, natrium pyrofosfaat, β-glycerofosfaat
 Tyrosine fosfatasen
o Inhibitoren: natrium orthovanadaat
 (Detergent) -> oplossen celmembraan als eiwit niet goed oplost
 NP40, Triton-X100, CHAPS, SDS
 (Reducerend agens) -> afbraak disulfidebruggen
 DTT, β-ME


Aanmaken van eiwitten

Chemische synthese in vitro:

 Werking
1. Koppeling AZ (C-terminus) + peptide linker met harsparel
2. Verwijderen N-terminale beschermingsgroep (N α-deprotectie)
3. Repetitieve cylci: koppeling volgende AZ (C-terminus) op N-terminus
4. Nα-deprotectie + afklieven harsparel en linker + zijketen deprotectie
 Voordelen
 Synthese artificiële eiwitten (ingebouwde artificiële AZ -> niet gecodeerd door
genoom) => ontstaan stabielere eiwitten / actievere enzymen / …
 Geen probleem voor:
o Toxiciteit v eiwit vr organisme dat het zou moeten aanmaken


2

, o AZ-beschikbaarheid
 Nadelen
 Koppelingsefficiëntie per cyclus: 99%
o Verlaagde opbrengst bij elk extra AZ
o Enkel korte sequenties => oplossing: koppeling kortere eiw voor aanmaak
langere eiw
 Duur
 Kleine hoeveelheden
 Toepassingen
 Antistofproductie
 Artificiële eiwitten

Enzymatische synthese in vitro:

 Werking (gekoppeld met in vitro transcriptie)
 In vitro translatie RNA -> in reticulocyt lysaat (konijn) / tarwekiem extract
o Bevat: ribosomen + AZ + energie
 Koppeling met in vitro transcriptie
 Voordelen
 Makkelijk + snel
 Nadelen
 Kleine hoeveelheden
 Toepassingen
 Karakteriseren ORF (open reading frame)
 Structurele en functionele studies

In vivo expressie systemen:

 Recombinante eiwitproductie: introductie recombinant DNA vr expressie recombinant eiw
 BELANGRIJK: keuze organisme bepaalt keuze expressie plasmide + eiwitcoderende
sequentie = codon optimalisatie
o Aanpassen coderende sequentie -> hogere eiwitexpressie
 Synonieme codons gebruiken wr veel tRNA beschikbaar is in dat
organisme/celtype
 Eiwitproductie
 Transiënt -> werkt maar enkele dagen
o Transfectie: geen integratie recombinant DNA in genoom expressie
organisme
 Stabiel -> maanden
o Transductie: integratie recombinant DNA in genoom expressie organisme
 Schaal productie
 Laboratoriumschaal -> kleine volumes (1 mL – 1L)
 Industriële schaal -> tot bioreactor productietank (1000 L)
 Expressie systemen
 Bacterie
o Soorten
 E.Coli
 Bacillus subtilis -> eiwitsecretie in medium
o Voordelen
 Makkelijk manipuleerbaar
 Goedkope cultuurmedia


3

,  Induceerbare promotoren (productie aanzetten als voldoende
bacteriën aanwezig)
 IPTG: inactiveert lac repressor -> transcriptie gen + translatie
o Nadelen
 Foute post-translationele modificaties
 Foute opvouwing + oplosbaarheid v eiw
=> aggregatie in inclusion bodies
 Kan ook voordeel zijn
 Geen last van toxicitiet door eiw
 Beschermd tegen proteolyse
 Zuiver + hoog geconcentreerde eiwitten
o Nieuw: artificiële bacteriële ribosomen (Ribo-T)
 Principe
 Artificiële ribosomen toevoegen -> herkennen andere Shine-
Dalgarno sequentie DUS translatie andere set mRNA
 Voordelen
 Betere leefbaarheid bacterie -> endogene ribosomen ku
endogene eiw blijven aanmaken
 Mogelijkheid artificiële AZ inbouwen
 Nadelen
 Niet volledig ontwikkeld
 Enkel in bacteriën
 Gist
o Soorten
 Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist)
 Pichia pastoris
 Minder immunogene glycosylaitepatronen (lijken beter op
mens)
 Groeien aan hogere celdensitiet -> hogere eiwitopbrengst
o Voordelen
 Makkelijk op te schalen
 Goedkoop
 Hoge expressie
 Secretie eiwit in medium
 Vectoren met
 Constitutieve promotoren: altijd actief
 Induceerbare promotoren: regelbaar
 S. cerevisiae: methanol induceerbaar
 P. pastoris: fosfaat induceerbaar
o Nadelen
 Foute post-translationele modificaties + vouwing eiw
 Plant (cellen / volledige planten)
o Soorten
 Volledig transgene planten (stabiel) -> wel integratie
 Transiënte expressie via agrobacteriën -> geen integratie in genoom
plant
 Insect cellen
o Soorten
Combi met baculovirus expressie  S2 cellen (Schneider 2) -> afgeleid v macrofagen embryo’s fruitvlieg
systemen -> veilig maken vr de mens  Sf9 en Sf21 cellen -> afgeleid v ovaria legerrups
o Voordelen

4