Cel- en genbiotechnologie
Hoofdstuk 1: Inleiding
Gram positieve bacteriën: dikke celwand
Gram negatieve bacteriën: buitenmembraan, dunne celwand
Virussen: enveloppe of niet? (virussen zonder enveloppe hebben een eiwitmantel die makkelijk
open te krijgen is), dikke eiwitmantel of niet?
1. DNA
= desoxyribonucleïnezuur
= drager van erfelijk materiaal
DNA bestaat uit een dubbele helix en heeft complementaire strengen.
Bacteriën hebben een stukje DNA dat maakt of ze virulent of niet-pathogeen (niet-virulent) zijn.
2. Recombinant DNA
= het is een combinatie van genetisch materiaal (DNA) die met behulp van recombinant-DNA-
technologie door de mens op kunstmatige wijze in een laboratorium is verkregen en niet als zodanig
in de natuur voorkomt. Er wordt een combinatie gevormd van DNA afkomstig uit organismen of
virussen van dezelfde of verschillende soorten.
Het kan synthetisch aangemaakt worden en wordt dus niet gekweekt zoals met vroegere methodes.
Verschil met DNA weten: DNA komt van nature voor, het is niet synthetisch gemaakt.
3. GMO’s
= genetisch gemodificeerde organisme
= recombinant DNA wordt gebruikt om gericht bepaalde eigenschappen mee te geven aan
organismen. Het wordt gebruikt om organismen nieuwe functies te geven of om een gen uit te
schakelen.
Voorbeelden: katoenplant waar gen toxine aan toegevoegd is
4. Technieken recombinant DNA technologie
DNA-isolatie
DNA wordt opgezuiverd door het DNA in een schaal te scheiden van andere biomoleculen zoals
eiwitten, celmembranen en andere cellulaire componenten.
Celmembranen wordt eerst gelyseerd en vervolgens worden onzuiverheden (zoals eiwitten)
verwijderd.
Fysieke methoden: vermalen of pletten van het monster om de celwanden of het taaie weefsel te
verstoren:
,Cel- en genbiotechnologie
Mechanische kralen (‘beads’)
Isopropanol of ethanol toevoegen om DNA te doen neerslaag op het oppervlak.
Extra info: Alcohol percentage kan gebruikt worden om de grootte van je opgzuiverde
fragmenten te verkrijgen.à Nood aan lang (HMW) DNA, best geen bead beating gebruiken,
zwakke lysis methoden selecteren.
Filterpapier DNA-extractie
Snel, handig, veel afva
Eerst cellen doen openspringen door helder lysaat toe te voegen
(= DNA binding), vervolgens ethanol eerst toevoegen en dan
afwassen. Dan TE buffer toevoegen, DNA gaat elueren (= DNA
elutie).
Chemische methoden: Lysis door organische solventen:
Fenol-chloroform methode:
Fenol en chloroform zijn gevaarlijke stoffen, maar techniek is efficiënt en goedkoop.
Dit gebruiken als klassieke methodes niet goed werken.
Chloroform verhoogt de dichtheid van phenol, waardoor er phase separation optreedt: DNA
en RNA zijn opgelost in de waterige fase (want ze zijn hydrofiel), lipiden etc zijn opgelost in
de organische fase.
Dan isopropanol toevoegen waardoor DNA en RNA neerslaat en geëxtraheerd kan worden.
Enzymatische methoden: Lysis door enzyme die de celwand verzwakken en/of afbreken
Proteïnase K methode
= combinatie van detergent om celmembraan af te breken en proteïnase K voor
proteïnecomplexen af te breken.
Lysozyme / mutanolysine (vr gram pos bacteriën met dikke celwand).
Commerciële kits (zie dia 21): veiliger, sneller en gemakkelijker
Kits op basis van filtreerpapier
Kits op basis van magneten
DNA precipitatie
DNA uit oplossing precipiteren door ethanol of ispropanol in aanwezigheid van zouten. (zie functie
ethanol hierboven)
1. Zout toevoegen: neutraliseren van de lading van DNA waardoor het minder hydrofiel wordt
(om lading te veranderen om het meer/ minder te laten neerslaan).
2. Precipitatie gebeurt op ijs: lage temperatuur bevordert flocculatie van DNA (ijs wordt
gebruikt om DNA te laten neerslaan).
3. Een nucleïnezuurconcentratie die hoog genoeg is om het DNA uit de oplossing te dwingen
(als de concentratie niet hoog genoeg is, kunt u een dragernucleïnezuur of glycogeen
toevoegen om het herstel te bevorderen).
4. Centrifugeren
DNA kwantificatie
,Cel- en genbiotechnologie
Hoeveelheid DNA bepalen met:
- Spectrofotometrie bij UV-licht (concentratie en zuiverheid bepalen)
Metingen van absorbantie bij 260 en 280 nm.
Zuivere DNA-oplossing: A260/A280 = 1,8
Zuivere RNA-oplossing: A260/A280 = 2,0
- Fluorometer kwantificatie
DNA fluorescent kleuren met fluorescerende DNA intercalerende stoffen.
Gevoeliger, geen zuiverheidsmeting
Scheiden van DNA fragmenten dmv elektroforese
Biomoleculen scheiden van elkaar op basis van lengte (~moleculair gewicht) onder invloed van een
elektrisch veld. Dit wordt ook gebruikt om de grootte van fragmenten te bepalen.
DNA en RNA zijn negatief geladen, dus migreren naar anode (positieve kant).
Gelmaterialen:
- Agarose: materiaal van de gel om DNA en RNA te scheiden
Agarose is een lineair heteropolysaccharide geïsoleerd uit zeewier
Horizontale gel
Grotere strengen zullen trager doorheen de gelmatrix migreren dan de kleinere stukken,
waardoor de nucleïnezuren volgens hun grootte gescheiden zullen worden.
1% agarose in deze agarosegel: Een hoger agarosepercentage verbetert de resolutie van
kleinere banden; omgekeerd geeft een lager agarosepercentage een betere resolutie en
scheiding van banden met een hoger molecuulgewicht (dus grote fragmenten kan je beter
scheiden bij minder agarose).
- Acrylamide: materiaal van gel dat gebruikt wordt om eiwitten te scheiden
Verticale gel
Heel fragiel
RNA is enkelstrengig en vormt secundaire en tertiaire structuren, dat beïnvloedt het
migratieproces. Reagentia wordt toegevoegd die basenparing van RNA-moleculen voorkomt,
waardoor er geen secundaire en tertiaire structuren gevormd kunnen worden, waardoor de
scheiding zal plaatsvinden op basis van molecuulgrootte.
DNA visualisatie
DNA in gelelektroforese zichtbaar maken om concentratie en zuiverheid van je DNA staal te bepalen
door fluorescente kleurstoffen te gebruiken:
- Ethidiumbromide: intercaleert in dubbelstrengig DNA en is zichtbaar met UV-licht, mutagene
stof.
- Gelred: interacleert ook in dubbelstrengig DNA, maar is gevoeliger en kan ook gebruikt
worden voor enkelstrengig DNA en RNA en is ook zichtbaar met UV-licht. Het is veiliger,
want het kan niet door celmembranen diffunderen.
- SYBR geen, Pico-green: met zichtbaar licht
Ladder gebruiken, bv. Lambda ladder
, Cel- en genbiotechnologie
PCR
= Polymerase Chain Reaction
Stappen:
1. Initiële denaturatie: DNA denatureren (enkelstrengig maken), dit gebeurt bij een bepaalde
temperatuur en tijd (DNA met veel GC moet langer).
2. Denaturatie
3. Anneaing: primers specifiek binden op enkelstrengig DNA. Die primers moeten
complementair zijn aan de doelwitregio. Temperatuur wordt verlaagd (temperatuur bepaald
obv doelwitsequentie), maar hoe lager de temperatuur, hoe minder specifiek de binding.
4. Extensie: DNA polymerase toevoegen die de primer heel specifiek gaat verlengen
25-35x herhalen
5. Finale extensie: vermenigvuldigen zodanig dat je voldoende materiaal hebt
6. Bewaren
Onderdelen van PCR reactie:
- DNA template
- DNA primers
- DNA polymerase
- dNTPs
- Magnesium chloride (MgCl2): positief geladen zout, het verbetert de activiteit van Taq DNA-
polymerase en helpt om primers te binden op de juiste plaats
- PCR buffer (zorgen voor optimale pH en zoutconcentratie)
Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
Reverse transcriptie= RNA wordt omgezet in complement DNA (cDNA) met het enzym reverse-
transcriptase (afkomstig van retrovirus).
Voordat PCR wordt uitgevoerd, wordt RNA eerst omgezet in cDNA.
Je gebruikt RT-PCR om de expressie van RNA te detecteren in een cel.
Kwantitatieve PCR (qPCR)
= Real-time PCR
Voor detectie en kwantificatie van DNA. DNA aangemaakt tijdens PCR, wordt gelabeld met
fluorescente labels (dyes of probes) waardoor tijdens PCR proces fluorescentie toeneem en gemeten
kan worden.
Met probes
Fluorescent gelabelde probes binden aan specifiek DNA stuk. Als polymerasekettingreactie
begint, wordt de probe afgebroken en wordt het label zichtbaar.
Specifieker dan dyes
Hoe minder cycli, hoe groter de concentratie target DNA in het begin. (zie ppt)
Hoofdstuk 1: Inleiding
Gram positieve bacteriën: dikke celwand
Gram negatieve bacteriën: buitenmembraan, dunne celwand
Virussen: enveloppe of niet? (virussen zonder enveloppe hebben een eiwitmantel die makkelijk
open te krijgen is), dikke eiwitmantel of niet?
1. DNA
= desoxyribonucleïnezuur
= drager van erfelijk materiaal
DNA bestaat uit een dubbele helix en heeft complementaire strengen.
Bacteriën hebben een stukje DNA dat maakt of ze virulent of niet-pathogeen (niet-virulent) zijn.
2. Recombinant DNA
= het is een combinatie van genetisch materiaal (DNA) die met behulp van recombinant-DNA-
technologie door de mens op kunstmatige wijze in een laboratorium is verkregen en niet als zodanig
in de natuur voorkomt. Er wordt een combinatie gevormd van DNA afkomstig uit organismen of
virussen van dezelfde of verschillende soorten.
Het kan synthetisch aangemaakt worden en wordt dus niet gekweekt zoals met vroegere methodes.
Verschil met DNA weten: DNA komt van nature voor, het is niet synthetisch gemaakt.
3. GMO’s
= genetisch gemodificeerde organisme
= recombinant DNA wordt gebruikt om gericht bepaalde eigenschappen mee te geven aan
organismen. Het wordt gebruikt om organismen nieuwe functies te geven of om een gen uit te
schakelen.
Voorbeelden: katoenplant waar gen toxine aan toegevoegd is
4. Technieken recombinant DNA technologie
DNA-isolatie
DNA wordt opgezuiverd door het DNA in een schaal te scheiden van andere biomoleculen zoals
eiwitten, celmembranen en andere cellulaire componenten.
Celmembranen wordt eerst gelyseerd en vervolgens worden onzuiverheden (zoals eiwitten)
verwijderd.
Fysieke methoden: vermalen of pletten van het monster om de celwanden of het taaie weefsel te
verstoren:
,Cel- en genbiotechnologie
Mechanische kralen (‘beads’)
Isopropanol of ethanol toevoegen om DNA te doen neerslaag op het oppervlak.
Extra info: Alcohol percentage kan gebruikt worden om de grootte van je opgzuiverde
fragmenten te verkrijgen.à Nood aan lang (HMW) DNA, best geen bead beating gebruiken,
zwakke lysis methoden selecteren.
Filterpapier DNA-extractie
Snel, handig, veel afva
Eerst cellen doen openspringen door helder lysaat toe te voegen
(= DNA binding), vervolgens ethanol eerst toevoegen en dan
afwassen. Dan TE buffer toevoegen, DNA gaat elueren (= DNA
elutie).
Chemische methoden: Lysis door organische solventen:
Fenol-chloroform methode:
Fenol en chloroform zijn gevaarlijke stoffen, maar techniek is efficiënt en goedkoop.
Dit gebruiken als klassieke methodes niet goed werken.
Chloroform verhoogt de dichtheid van phenol, waardoor er phase separation optreedt: DNA
en RNA zijn opgelost in de waterige fase (want ze zijn hydrofiel), lipiden etc zijn opgelost in
de organische fase.
Dan isopropanol toevoegen waardoor DNA en RNA neerslaat en geëxtraheerd kan worden.
Enzymatische methoden: Lysis door enzyme die de celwand verzwakken en/of afbreken
Proteïnase K methode
= combinatie van detergent om celmembraan af te breken en proteïnase K voor
proteïnecomplexen af te breken.
Lysozyme / mutanolysine (vr gram pos bacteriën met dikke celwand).
Commerciële kits (zie dia 21): veiliger, sneller en gemakkelijker
Kits op basis van filtreerpapier
Kits op basis van magneten
DNA precipitatie
DNA uit oplossing precipiteren door ethanol of ispropanol in aanwezigheid van zouten. (zie functie
ethanol hierboven)
1. Zout toevoegen: neutraliseren van de lading van DNA waardoor het minder hydrofiel wordt
(om lading te veranderen om het meer/ minder te laten neerslaan).
2. Precipitatie gebeurt op ijs: lage temperatuur bevordert flocculatie van DNA (ijs wordt
gebruikt om DNA te laten neerslaan).
3. Een nucleïnezuurconcentratie die hoog genoeg is om het DNA uit de oplossing te dwingen
(als de concentratie niet hoog genoeg is, kunt u een dragernucleïnezuur of glycogeen
toevoegen om het herstel te bevorderen).
4. Centrifugeren
DNA kwantificatie
,Cel- en genbiotechnologie
Hoeveelheid DNA bepalen met:
- Spectrofotometrie bij UV-licht (concentratie en zuiverheid bepalen)
Metingen van absorbantie bij 260 en 280 nm.
Zuivere DNA-oplossing: A260/A280 = 1,8
Zuivere RNA-oplossing: A260/A280 = 2,0
- Fluorometer kwantificatie
DNA fluorescent kleuren met fluorescerende DNA intercalerende stoffen.
Gevoeliger, geen zuiverheidsmeting
Scheiden van DNA fragmenten dmv elektroforese
Biomoleculen scheiden van elkaar op basis van lengte (~moleculair gewicht) onder invloed van een
elektrisch veld. Dit wordt ook gebruikt om de grootte van fragmenten te bepalen.
DNA en RNA zijn negatief geladen, dus migreren naar anode (positieve kant).
Gelmaterialen:
- Agarose: materiaal van de gel om DNA en RNA te scheiden
Agarose is een lineair heteropolysaccharide geïsoleerd uit zeewier
Horizontale gel
Grotere strengen zullen trager doorheen de gelmatrix migreren dan de kleinere stukken,
waardoor de nucleïnezuren volgens hun grootte gescheiden zullen worden.
1% agarose in deze agarosegel: Een hoger agarosepercentage verbetert de resolutie van
kleinere banden; omgekeerd geeft een lager agarosepercentage een betere resolutie en
scheiding van banden met een hoger molecuulgewicht (dus grote fragmenten kan je beter
scheiden bij minder agarose).
- Acrylamide: materiaal van gel dat gebruikt wordt om eiwitten te scheiden
Verticale gel
Heel fragiel
RNA is enkelstrengig en vormt secundaire en tertiaire structuren, dat beïnvloedt het
migratieproces. Reagentia wordt toegevoegd die basenparing van RNA-moleculen voorkomt,
waardoor er geen secundaire en tertiaire structuren gevormd kunnen worden, waardoor de
scheiding zal plaatsvinden op basis van molecuulgrootte.
DNA visualisatie
DNA in gelelektroforese zichtbaar maken om concentratie en zuiverheid van je DNA staal te bepalen
door fluorescente kleurstoffen te gebruiken:
- Ethidiumbromide: intercaleert in dubbelstrengig DNA en is zichtbaar met UV-licht, mutagene
stof.
- Gelred: interacleert ook in dubbelstrengig DNA, maar is gevoeliger en kan ook gebruikt
worden voor enkelstrengig DNA en RNA en is ook zichtbaar met UV-licht. Het is veiliger,
want het kan niet door celmembranen diffunderen.
- SYBR geen, Pico-green: met zichtbaar licht
Ladder gebruiken, bv. Lambda ladder
, Cel- en genbiotechnologie
PCR
= Polymerase Chain Reaction
Stappen:
1. Initiële denaturatie: DNA denatureren (enkelstrengig maken), dit gebeurt bij een bepaalde
temperatuur en tijd (DNA met veel GC moet langer).
2. Denaturatie
3. Anneaing: primers specifiek binden op enkelstrengig DNA. Die primers moeten
complementair zijn aan de doelwitregio. Temperatuur wordt verlaagd (temperatuur bepaald
obv doelwitsequentie), maar hoe lager de temperatuur, hoe minder specifiek de binding.
4. Extensie: DNA polymerase toevoegen die de primer heel specifiek gaat verlengen
25-35x herhalen
5. Finale extensie: vermenigvuldigen zodanig dat je voldoende materiaal hebt
6. Bewaren
Onderdelen van PCR reactie:
- DNA template
- DNA primers
- DNA polymerase
- dNTPs
- Magnesium chloride (MgCl2): positief geladen zout, het verbetert de activiteit van Taq DNA-
polymerase en helpt om primers te binden op de juiste plaats
- PCR buffer (zorgen voor optimale pH en zoutconcentratie)
Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
Reverse transcriptie= RNA wordt omgezet in complement DNA (cDNA) met het enzym reverse-
transcriptase (afkomstig van retrovirus).
Voordat PCR wordt uitgevoerd, wordt RNA eerst omgezet in cDNA.
Je gebruikt RT-PCR om de expressie van RNA te detecteren in een cel.
Kwantitatieve PCR (qPCR)
= Real-time PCR
Voor detectie en kwantificatie van DNA. DNA aangemaakt tijdens PCR, wordt gelabeld met
fluorescente labels (dyes of probes) waardoor tijdens PCR proces fluorescentie toeneem en gemeten
kan worden.
Met probes
Fluorescent gelabelde probes binden aan specifiek DNA stuk. Als polymerasekettingreactie
begint, wordt de probe afgebroken en wordt het label zichtbaar.
Specifieker dan dyes
Hoe minder cycli, hoe groter de concentratie target DNA in het begin. (zie ppt)
