FLOW CYTOMETRIE EN MOLECULAIRE
DIAGNOSTIEK
HEMATOLOGIE
FLOW CYTOMETRIE
INLEIDING
Flow cytometrie is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om (bloed)cellen te analyseren terwijl ze in een
vloeistofstroom door een laserstraal bewegen. Het wordt vaak ingezet voor het tellen, sorteren en karakteriseren
van cellen o.b.v. bepaalde eigenschappen (grootte, vorm en de aanwezigheid van specifieke moleculaire
merkers). Binnen de hematologie wordt er gebruik gemaakt van specifieke fluorescerende merkers om
onderscheid te maken tussen de verschillende bloedceltypen en om abnormale cellen te identificeren.
Flow: fluid, cyto: cells, metry: measure → Het meten van eigenschappen van cellen in een vloeistofstroom.
• Flow cytometrie is een single cell measurement dus er wordt 1 cel tegelijkertijd gemeten (<-> bulk
method, bv. ELISA).
• Er kunnen heel veel cellen in een korte tijd geanalyseerd worden:
o ~300 cellen/sec (<-> microscoop)
o ~100 000 cellen/meting
• Afhankelijk van het instrument kunnen er verschillende parameters van 1 cel bepaald worden op
hetzelfde moment.
PRINCIPE
Monstervoorbereiding: Eerst worden bloedmonsters voorbereid waarbij cellen uit een bloedmonster worden
gesuspendeerd in een vloeibare oplossing. Vervolgens worden specifieke antilichamen aan het monster
toegevoegd die gericht zijn tegen eiwitten of antigenen op het celoppervlak. Deze antilichamen zijn gelabeld met
fluorochromen, die zullen oplichten wanneer ze door de laser van de flow cytomter worden beschenen.
Hydrodynamische focussering : Het bloedmonster wordt door een smalle buis geleid in de flowcytometer, waar
de cellen één voor één door een laserstraal passeren. Door de hydrodynamische focussering blijven de cellen
geïsoleerd, wat zorgt voor een nauwkeurige en individuele analyse van elke cel.
Laserbestraling en lichtverstrooiing: Terwijl elke cel door de laserstraal beweegt, worden twee typen
lichtsignalen geproduceerd:
• Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC): grootte van de cel (grotere cellen geven sterker FSC-signaal)
• Zijwaartse verstrooiing (SSC): interne structuur en granulariteit van de cel (meer interne structuren is
sterker SSC-signaal)
Fluorescentieanalyse: De cellen die gelabeld zijn met specifieke fluorescerende antilichamen worden door de
laser geactiveerd, waardoor de fluorochromen oplichten. Elke fluorescerende merker straalt op een specifieke
golflengte, en deze emissies worden gemeten door detectoren. Door het gebruik van verschillende
fluorochromen, kan er een onderscheid gemaakt worden tussen verschillende soorten bloedcellen.
1
,3 SUBSYSTEMEN
Vloeistofsysteem
• Hydrodynamische focussering
• Cellen worden gepresenteerd aan de laser
Optisch systeem
Het licht wordt verstrooid:
• In dezelfde richting als de laserlijn = forward
scatter (FS)
• Naar de zijkant = side scatter (SS)
Op de afbeelding is het optische pad van de flow cytometer te zien, waarin lichtverstrooiing en fluorescentie worden
gedetecteerd. De laser(s) belicht(en) het monster, die de fluorescentgelabelde cellen en de verstrooiing van licht door de
cellen detecteert. De collection lenzen verzamelen het verstrooide en uitgezonden licht van de cellen. Dit wordt doorgestuurd
naar verschillende detectoren (na spiegels en filters). De dichroïsche spiegels splitsen het licht o.b.v. golflengte. Elke spiegel
reflecteert een specifieke golflengte naar de corresponderende detector, terwijl andere golflengtes worden doorgelaten. Zo
worden verschillende fluorescerende kleuren gescheiden. De band pass filters laten alleen specifieke golflengtes door naar
de fotomultiplier tubes, wat zorgt voor een nauwkeurige detectie van de verschillende kleuren fluorescentielicht. De PTM’s
versterken de lichtsignalen en zetten ze om in elektrische signalen die worden verwerkt. Hier worden 3 detectoren
weergegeven (1,2 en 3) die elk een andere kleur fluorescentielicht meten. De PTM’s zijn eigenlijk de daadwerkelijke
detectoren
Elektronisch systeem:
Conversie van optische signalen naar digitale signalen voor display.
SPECIMEN TYPES
De voorwaarde voor flow cytometrie: cellen in een single cell suspensie.
• Perifeer bloed en beenmerg: deze zijn ideaal, want ze zitten al in een vloeistof
• Vochten: cerebrospinaal vocht, pleuravocht, gewrichtsvocht, deze bevatten minder cellen
• Weefsels na behandeling: de weefsels moeten eerst behandeld/ geplet worden zodat de cellen
loskomen en ze bestudeerd kunnen worden
• Andere types: chromosomen, bacteriën, algen, schimmels,..
IMMUNOFENOTYPERING IN DE PRAKTIJK
1. Cellen in suspensie (‘single cells’)
2. Levensvatbare cellen
3. 5-10 miljoen cellen/ ml: met veel cellen beginnen, zodat er veel gemeten kunnen worden
4. Lyse van rode bloedcellen
a. Lysemiddel: NH4Cl of een commercieel beschikbare lysebuffer
5. Incubatie met monoclonale antilichamen
6. Wassen (om achtergrondfluorescentie te verminderen)
7. Meten met de flow cytometer
8. Correcte “gating”: kijken naar de verschillende celpopulaties
9. Resultaten in %
2
,IMMUNOFENOTYPERING IN HET UZA
DxFLEX (Beckman coulter): 13-color flow cytometer
• 3 lasers
• Avalanche photodiode detectors (APD)
• 13 kanalen voor fluorescentie (momenteel 10 in gebruik, dus nooit meer dan 10 kleuren in 1 meting)
• FS & SS
Load&go Flowcytometer: Aquios (Beckman coulter): 5-color flow cytometer
• Load&go: voorbehandeling is niet nodig, bloed toevoegen en toestel doet voorbehandeling
• 1 laser
• Photomultiplier tubes (PTM)
• 5 kanalen voor fluorescentie
• FS & SS
• Electronisch volume (EV): exacte aantallen kunnen bepaald worden van de celpopulaties
• Kan slechts 2 tests: lymfocyt subsets en CD34 counting
LEVENSVATBARE CELLEN
Vers materiaal is vereist voor diagnostische immunofenotypering!! Als het monster ingevroren of gefixeerd is →
GEEN flow cytometrie!
De forward scatter is gerelateerd aan de grootte van de cel, de side scatter is gerelateerd aan de interne
structuur/ complexiteit van de cel.
• Een gecorreleerde meting tussen de twee kan differentiatie van celtypes in een heterogene celpopulatie
mogelijk maken.
FORWARD SCATTER EN SIDE SCATTER
Normaal staal
Software waarmee kleur en vorm gegeven kan worden
Voorbeeld van wat er afgeleid kan worden uit side
scatters
Oud: granulocyten zijn vervormd → lagere side
scatter
Afwijkend: granulocyten zijn ontkorreld → lagere side scatter
Vnl. lymfocyten worden besproken, maar ook monocyten en granulocyten. RBC worden gelyseerd!
3
, • L (lymfocyten): lage SS en FS
• M (monocyten): zijn iets groter dus hogere FS en ook hogere SS
• G (granulocyten): veel hogere SS door hun grotere interne complexiteit/ granulariteit
LYMFOCYT SUBSETS: T-TYPERING
T-cel typering
Overzicht van de merkers en fluorescentiekleuren (fluorochromen) die worden gebruikt om verschillende types
van T-cellen en witte bloedcellen te identificeren in een flow cytometrie-analyse.
• FL-kanalen: (FL1-FL10): vertegenwoordigen de verschillende fluorescente kanalen van de
flowcytometer. Elk kanaal meet een specifieke kleur/ golflengte van fluorescent licht, afkomstig van
verschillende fluorochromen. Bv.: FL1 is een kanaal dat afgestemd is op de emissie van het FITC-
fluorochroom.
• Merker (CD-moleculen): specifieke celmerkers die door een fluorescent gelabeld antilichaam worden
herkend. Bv.: CD3 is een algemene merker voor T-cellen, CD8 is een merker voor cytotoxische T-cellen,..
Hier wordt CD8 gedetecteerd in het FL1 (FITC) kanaal.
• Celtype: de celtypes die worden geïdentificeerd o.b.v. de merker-expressie. Bv: cytotoxische T-cellen
(CD8 positieve cellen) worden geïdentificeerd met CD8 in FL1.
Als we nu enkel de T-cellen willen typeren, gebruiken we enkel de merkers die hiervoor nodig zijn. De lege vakjes
die hier zijn aangeduid blijven dus leeg.
FCM: GATING
FCM = flow cytometrie
Bij gating worden er specifieke populaties van cellen geselecteerd voor analyse. Het wordt gebruikt om alleen de
cellen met bepaalde kenmerken (grootte, granulariteit of expressie van opp.-eiwitten) in de analyse op te nemen,
terwijl andere cellen worden uitgesloten. Dit helpt bij het onderzoeken van specifieke celtypes in een complex
monster zoals bloed of beenmerg.
Een gate is een virtueel venster dat wordt getekend op een scatterplot of histogram. Er kan bv. een gate getekend
worden rond een specifieke cluster van punten die een bepaalde celpopulatie vertegenwoordigen. Gates kunnen
toegepast worden op:
• Voorwaartse verstrooiing (FS) vs. zijwaartse verstrooiing (SS) scatterplots: geeft info over grootte en
interne structuur/ granulariteit van de cellen → cellen met verschillende morfologische eigenschappen
(lymfocyten, monocyten en granulocyten) kunnen zo gescheiden worden.
• Histogrammen/ dot plots die fluorescentie-intensiteit weergeven: bv. enkel cellen die CD3 en CD4 tot
expressie brengen worden geselecteerd voor analyse.
• Mulit-level gating: bv. eerst een gate om alleen WBC’s te selecteren en daarna een tweede gate om T-
cellen (CD3-positieve cellen) te isoleren enzovoort.
4
DIAGNOSTIEK
HEMATOLOGIE
FLOW CYTOMETRIE
INLEIDING
Flow cytometrie is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om (bloed)cellen te analyseren terwijl ze in een
vloeistofstroom door een laserstraal bewegen. Het wordt vaak ingezet voor het tellen, sorteren en karakteriseren
van cellen o.b.v. bepaalde eigenschappen (grootte, vorm en de aanwezigheid van specifieke moleculaire
merkers). Binnen de hematologie wordt er gebruik gemaakt van specifieke fluorescerende merkers om
onderscheid te maken tussen de verschillende bloedceltypen en om abnormale cellen te identificeren.
Flow: fluid, cyto: cells, metry: measure → Het meten van eigenschappen van cellen in een vloeistofstroom.
• Flow cytometrie is een single cell measurement dus er wordt 1 cel tegelijkertijd gemeten (<-> bulk
method, bv. ELISA).
• Er kunnen heel veel cellen in een korte tijd geanalyseerd worden:
o ~300 cellen/sec (<-> microscoop)
o ~100 000 cellen/meting
• Afhankelijk van het instrument kunnen er verschillende parameters van 1 cel bepaald worden op
hetzelfde moment.
PRINCIPE
Monstervoorbereiding: Eerst worden bloedmonsters voorbereid waarbij cellen uit een bloedmonster worden
gesuspendeerd in een vloeibare oplossing. Vervolgens worden specifieke antilichamen aan het monster
toegevoegd die gericht zijn tegen eiwitten of antigenen op het celoppervlak. Deze antilichamen zijn gelabeld met
fluorochromen, die zullen oplichten wanneer ze door de laser van de flow cytomter worden beschenen.
Hydrodynamische focussering : Het bloedmonster wordt door een smalle buis geleid in de flowcytometer, waar
de cellen één voor één door een laserstraal passeren. Door de hydrodynamische focussering blijven de cellen
geïsoleerd, wat zorgt voor een nauwkeurige en individuele analyse van elke cel.
Laserbestraling en lichtverstrooiing: Terwijl elke cel door de laserstraal beweegt, worden twee typen
lichtsignalen geproduceerd:
• Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC): grootte van de cel (grotere cellen geven sterker FSC-signaal)
• Zijwaartse verstrooiing (SSC): interne structuur en granulariteit van de cel (meer interne structuren is
sterker SSC-signaal)
Fluorescentieanalyse: De cellen die gelabeld zijn met specifieke fluorescerende antilichamen worden door de
laser geactiveerd, waardoor de fluorochromen oplichten. Elke fluorescerende merker straalt op een specifieke
golflengte, en deze emissies worden gemeten door detectoren. Door het gebruik van verschillende
fluorochromen, kan er een onderscheid gemaakt worden tussen verschillende soorten bloedcellen.
1
,3 SUBSYSTEMEN
Vloeistofsysteem
• Hydrodynamische focussering
• Cellen worden gepresenteerd aan de laser
Optisch systeem
Het licht wordt verstrooid:
• In dezelfde richting als de laserlijn = forward
scatter (FS)
• Naar de zijkant = side scatter (SS)
Op de afbeelding is het optische pad van de flow cytometer te zien, waarin lichtverstrooiing en fluorescentie worden
gedetecteerd. De laser(s) belicht(en) het monster, die de fluorescentgelabelde cellen en de verstrooiing van licht door de
cellen detecteert. De collection lenzen verzamelen het verstrooide en uitgezonden licht van de cellen. Dit wordt doorgestuurd
naar verschillende detectoren (na spiegels en filters). De dichroïsche spiegels splitsen het licht o.b.v. golflengte. Elke spiegel
reflecteert een specifieke golflengte naar de corresponderende detector, terwijl andere golflengtes worden doorgelaten. Zo
worden verschillende fluorescerende kleuren gescheiden. De band pass filters laten alleen specifieke golflengtes door naar
de fotomultiplier tubes, wat zorgt voor een nauwkeurige detectie van de verschillende kleuren fluorescentielicht. De PTM’s
versterken de lichtsignalen en zetten ze om in elektrische signalen die worden verwerkt. Hier worden 3 detectoren
weergegeven (1,2 en 3) die elk een andere kleur fluorescentielicht meten. De PTM’s zijn eigenlijk de daadwerkelijke
detectoren
Elektronisch systeem:
Conversie van optische signalen naar digitale signalen voor display.
SPECIMEN TYPES
De voorwaarde voor flow cytometrie: cellen in een single cell suspensie.
• Perifeer bloed en beenmerg: deze zijn ideaal, want ze zitten al in een vloeistof
• Vochten: cerebrospinaal vocht, pleuravocht, gewrichtsvocht, deze bevatten minder cellen
• Weefsels na behandeling: de weefsels moeten eerst behandeld/ geplet worden zodat de cellen
loskomen en ze bestudeerd kunnen worden
• Andere types: chromosomen, bacteriën, algen, schimmels,..
IMMUNOFENOTYPERING IN DE PRAKTIJK
1. Cellen in suspensie (‘single cells’)
2. Levensvatbare cellen
3. 5-10 miljoen cellen/ ml: met veel cellen beginnen, zodat er veel gemeten kunnen worden
4. Lyse van rode bloedcellen
a. Lysemiddel: NH4Cl of een commercieel beschikbare lysebuffer
5. Incubatie met monoclonale antilichamen
6. Wassen (om achtergrondfluorescentie te verminderen)
7. Meten met de flow cytometer
8. Correcte “gating”: kijken naar de verschillende celpopulaties
9. Resultaten in %
2
,IMMUNOFENOTYPERING IN HET UZA
DxFLEX (Beckman coulter): 13-color flow cytometer
• 3 lasers
• Avalanche photodiode detectors (APD)
• 13 kanalen voor fluorescentie (momenteel 10 in gebruik, dus nooit meer dan 10 kleuren in 1 meting)
• FS & SS
Load&go Flowcytometer: Aquios (Beckman coulter): 5-color flow cytometer
• Load&go: voorbehandeling is niet nodig, bloed toevoegen en toestel doet voorbehandeling
• 1 laser
• Photomultiplier tubes (PTM)
• 5 kanalen voor fluorescentie
• FS & SS
• Electronisch volume (EV): exacte aantallen kunnen bepaald worden van de celpopulaties
• Kan slechts 2 tests: lymfocyt subsets en CD34 counting
LEVENSVATBARE CELLEN
Vers materiaal is vereist voor diagnostische immunofenotypering!! Als het monster ingevroren of gefixeerd is →
GEEN flow cytometrie!
De forward scatter is gerelateerd aan de grootte van de cel, de side scatter is gerelateerd aan de interne
structuur/ complexiteit van de cel.
• Een gecorreleerde meting tussen de twee kan differentiatie van celtypes in een heterogene celpopulatie
mogelijk maken.
FORWARD SCATTER EN SIDE SCATTER
Normaal staal
Software waarmee kleur en vorm gegeven kan worden
Voorbeeld van wat er afgeleid kan worden uit side
scatters
Oud: granulocyten zijn vervormd → lagere side
scatter
Afwijkend: granulocyten zijn ontkorreld → lagere side scatter
Vnl. lymfocyten worden besproken, maar ook monocyten en granulocyten. RBC worden gelyseerd!
3
, • L (lymfocyten): lage SS en FS
• M (monocyten): zijn iets groter dus hogere FS en ook hogere SS
• G (granulocyten): veel hogere SS door hun grotere interne complexiteit/ granulariteit
LYMFOCYT SUBSETS: T-TYPERING
T-cel typering
Overzicht van de merkers en fluorescentiekleuren (fluorochromen) die worden gebruikt om verschillende types
van T-cellen en witte bloedcellen te identificeren in een flow cytometrie-analyse.
• FL-kanalen: (FL1-FL10): vertegenwoordigen de verschillende fluorescente kanalen van de
flowcytometer. Elk kanaal meet een specifieke kleur/ golflengte van fluorescent licht, afkomstig van
verschillende fluorochromen. Bv.: FL1 is een kanaal dat afgestemd is op de emissie van het FITC-
fluorochroom.
• Merker (CD-moleculen): specifieke celmerkers die door een fluorescent gelabeld antilichaam worden
herkend. Bv.: CD3 is een algemene merker voor T-cellen, CD8 is een merker voor cytotoxische T-cellen,..
Hier wordt CD8 gedetecteerd in het FL1 (FITC) kanaal.
• Celtype: de celtypes die worden geïdentificeerd o.b.v. de merker-expressie. Bv: cytotoxische T-cellen
(CD8 positieve cellen) worden geïdentificeerd met CD8 in FL1.
Als we nu enkel de T-cellen willen typeren, gebruiken we enkel de merkers die hiervoor nodig zijn. De lege vakjes
die hier zijn aangeduid blijven dus leeg.
FCM: GATING
FCM = flow cytometrie
Bij gating worden er specifieke populaties van cellen geselecteerd voor analyse. Het wordt gebruikt om alleen de
cellen met bepaalde kenmerken (grootte, granulariteit of expressie van opp.-eiwitten) in de analyse op te nemen,
terwijl andere cellen worden uitgesloten. Dit helpt bij het onderzoeken van specifieke celtypes in een complex
monster zoals bloed of beenmerg.
Een gate is een virtueel venster dat wordt getekend op een scatterplot of histogram. Er kan bv. een gate getekend
worden rond een specifieke cluster van punten die een bepaalde celpopulatie vertegenwoordigen. Gates kunnen
toegepast worden op:
• Voorwaartse verstrooiing (FS) vs. zijwaartse verstrooiing (SS) scatterplots: geeft info over grootte en
interne structuur/ granulariteit van de cellen → cellen met verschillende morfologische eigenschappen
(lymfocyten, monocyten en granulocyten) kunnen zo gescheiden worden.
• Histogrammen/ dot plots die fluorescentie-intensiteit weergeven: bv. enkel cellen die CD3 en CD4 tot
expressie brengen worden geselecteerd voor analyse.
• Mulit-level gating: bv. eerst een gate om alleen WBC’s te selecteren en daarna een tweede gate om T-
cellen (CD3-positieve cellen) te isoleren enzovoort.
4
