MRSA informatie:
Staphylococcus aureus : Gram-positief, katalase-positieve kokken die geen sporen vormen en niet
beweeglijk zijn. Ook coagulase positief. Zijn potentieel pathogeen voor mens en dier. Het
ziekmakende vermogen van S. aureus wordt grotendeels bepaald door de aanwezigheid van
bepaalde virulentiefactoren.
Coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) : Staphylococcus epidermis
Methicilline resistentie bij S. aureus berust op de aanwezigheid van het mecA en mecC gen. De genen
coderen voor de productie van een gemodificeerd penicillinebindend eiwit, PBP-2a, wat resulteert in
ongevoeligheid voor bijna alle bètalactam antibiotica. Het mecA gen kan ook in CNS aanwezig zijn,
zoals in methicilline resistente S. epidermidis (MRSE).
Werkingsmechanisme bètalactam antibiotica : Het enzym PBP maakt crosslinks in de celwand. Zodra
het antibiotica bètalactam wordt toegevoegd, kan dit enzym geen crosslinks meer maken. Hierdoor
lyseert de bacterie en gaat dood.
Horizontale genoverdracht kan resulteren in aanpassingen in de bacterie waardoor deze resistent
wordt tegen bètalactam antibiotica.
1. Het enzym kan van vorm veranderen waardoor het antibiotica niet meer aan het enzym kan
binden. Hierdoor blijven de crosslinks in de cel. PBP -> PBP2a
2. Overnemen van plasmide, het enzym beta-lactamase wordt geproduceerd, wat aan de antibiotica
gaat binden waardoor het ervoor zorgt dat het medicijn stuk is, waardoor het de cel niet in kan.
De expressie van het mecA en mecC gen kan wisselen, wat kan resulteren in verschillende minimale
inhiberende concentraties (MIC).
Resistentiemechanisme van MRSA: MRSA stammen produceren PBP eiwitten. Dit zijn pencilline
bindende eiwitten. Het heeft een lage aantrekkingskracht voor antibiotica. Hierdoor worden er meer
enzymen geproduceerd die crosslinks vormen, maar deze crosslinks worden niet afgebroken door de
antibiotica.
1. LA-MRSA: livestock-associated MRSA, krijg je via veedieren.
2. CA-MRSA: community-associated MRSA, krijg je via de bevolking.
3. HA-MRSA: Healthcare-associated MRSA, krijg je via het ziekenhuis.
Wanneer er sprake is van een MRSA infectie wordt er meestal behandeld met antibiotica, tenzij de
infectie oppervlakkig en gelokaliseerd is zonder koorts. Welk antibioticum wordt ingezet is
afhankelijk van de gevoeligheid van de MRSA:
Muripirocine is neuszalf. Behandeling van oppervlakkige bacteriën. Het remt de bacteriële
eiwitsynthese.
Vancomycine is speciaal voor MRSA stammen. Het remt de bacteriële celwandsynthese, het tast de
permeabiliteit aan van de bacteriële celwand en het blokkeert de RNA-synthese.
Bloedagar is een niet-selectief, rijk medium, waar de meeste micro-organismen goed op kunnen
groeien.
MRSA chroomagar is een selectief medium met een chromogene mix: MRSA kolonies krijgen hierop
een bepaalde kleur (groen of roze). Kolonies die niet aankleuren of een andere kleur krijgen zijn niet
verdacht voor MRSA.
, Principe katalase: Deze test toont de aanwezigheid van katalase aan. Het wordt gebruikt om
bacteriën die het enzym katalase produceren (zoals stafylokokken) te onderscheiden van niet
katalase producerende bacteriën (zoals streptokokken). Het enzym zorgt voor de afbraak van
waterstofperoxide in zuurstof en water. De aanwezigheid van het enzym is duidelijke wanneer er
zuurstofbellen opkomen als een klein druppeltje van het materiaal in waterstofperoxide wordt
gebracht. Belangrijk is dat de cultuur niet ouder mag zijn dan 24 uur.
Principe coagulase: Deze test wordt gebruikt om staphylococcus aureus (positief) te onderscheiden
die het enzym coagulase produceren (negatief). Het principe van deze test is dat coagulase een
enzymachtig eiwit is en ervoor zorgt dat plasma stolt door fibrinogeen om om te zetten in fibrine.
Staphylococcus aureus produceert twee vormen van coagulase: gebonden (hierbij gaan cellen
klonteren) en vrij.
Bij een gevoeligheidsbepaling m.b.v. de disk-agardiffusie methode volgens Kirby en Bauer wordt
gebruik gemaakt van discen met een bepaalde hoeveelheid antibiotica. Een
gevoeligheidsvoedingsbodem (MH agar) wordt gelijkmatig beënt met een bepaald inoculum van de
te onderzoeken bacteriestam. De discen worden op de agar gelegd met de speciale dispenser en
overnacht geïncubeerd (en niet langer!). Vanuit de disc begint het antibioticum direct in de
voedingsbodem te diffunderen. In het medium ontwikkelt zich een gradiënt van antimicrobiële
concentraties, deze is het hoogst vlakbij het tabletje en neemt af naarmate de afstand groter wordt,
tot deze tenslotte 0 μg/ml is. De volgende dag wordt de diameter in millimeters van de
remmingszone gemeten (tot op 1 mm nauwkeurig)
Bij een E-test wordt in plaats van een disc, een stripje met verschillende concentraties antibiotica op
de beënte plaat gelegd. Vanuit de strip diffundeert een continue concentratiegradiënt van het
antibioticum in de agar. Deze strip bevat langs de ene kant een continue concentratiegradiënt van
een gestabiliseerd en gevriesdroogd antibioticum, en langs de andere kant een concentratieschaal
om de MIC-waarde te kunnen aflezen. Na incubatie kan de MIC afgelezen worden daar waar de
remmingszone de strip raakt.
Standaardisatie van inoculum dichtheid, dikte van de agarlaag en incubatietijd is essentieel bij een
gevoeligheidsbepaling. Voor een gevoeligheidsbepaling wordt een standaard van 0,5 McFarland (dit
komt overeen met 1,5 x108 bacteriën/mL) gebruikt.
Waarom wordt de gevoeligheid voor oxacilline getest en niet voor methicilline?
MRSA is resistent voor methicilline en antibiotica die hier op lijken. Wanneer de bacteriën die getest
worden resistent zijn voor oxacilline, zijn ze dit dus ook voor methicilline.
Naast de gevoeligheidsbepaling wordt ook de MRSA sneltest uitgevoerd. Deze test de aanwezigheid
van PBP2a: latex beads zijn gecoat met antilichamen tegen PBP2a. Als de S. aureus stam een
gemodificeerd PBP heeft (dus PBP2a ook wel PBP2’ genoemd), dan kunnen de antilichamen daaraan
binden en krijg je agglutinatie.
Deze multiplex PCR resulteert dus in 2 PCR producten, elk met een eigen fluorophore: een mecA
fragment, gelabeld met FAM en een nuc fragment, gelabeld met HEX. We zijn alleen geïnteresseerd
in de aanwezigheid van het mecA en nuc, niet in de expressie. Dit is dus een kwalitatieve PCR.
Bij QPCR wordt tijdens de reactie de vorming van de nieuwe fragmenten gevolgd, door ze te labellen met een
synthetische DNA-probe met een fluorescente kleurstof. Het aantal cycli waarbij het DNA-signaal boven de
detectiegrens (treshold) uitkomt (Ct-waarde) is een maat voor de oorspronkelijke DNA-concentratie in het
monster.
Staphylococcus aureus : Gram-positief, katalase-positieve kokken die geen sporen vormen en niet
beweeglijk zijn. Ook coagulase positief. Zijn potentieel pathogeen voor mens en dier. Het
ziekmakende vermogen van S. aureus wordt grotendeels bepaald door de aanwezigheid van
bepaalde virulentiefactoren.
Coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) : Staphylococcus epidermis
Methicilline resistentie bij S. aureus berust op de aanwezigheid van het mecA en mecC gen. De genen
coderen voor de productie van een gemodificeerd penicillinebindend eiwit, PBP-2a, wat resulteert in
ongevoeligheid voor bijna alle bètalactam antibiotica. Het mecA gen kan ook in CNS aanwezig zijn,
zoals in methicilline resistente S. epidermidis (MRSE).
Werkingsmechanisme bètalactam antibiotica : Het enzym PBP maakt crosslinks in de celwand. Zodra
het antibiotica bètalactam wordt toegevoegd, kan dit enzym geen crosslinks meer maken. Hierdoor
lyseert de bacterie en gaat dood.
Horizontale genoverdracht kan resulteren in aanpassingen in de bacterie waardoor deze resistent
wordt tegen bètalactam antibiotica.
1. Het enzym kan van vorm veranderen waardoor het antibiotica niet meer aan het enzym kan
binden. Hierdoor blijven de crosslinks in de cel. PBP -> PBP2a
2. Overnemen van plasmide, het enzym beta-lactamase wordt geproduceerd, wat aan de antibiotica
gaat binden waardoor het ervoor zorgt dat het medicijn stuk is, waardoor het de cel niet in kan.
De expressie van het mecA en mecC gen kan wisselen, wat kan resulteren in verschillende minimale
inhiberende concentraties (MIC).
Resistentiemechanisme van MRSA: MRSA stammen produceren PBP eiwitten. Dit zijn pencilline
bindende eiwitten. Het heeft een lage aantrekkingskracht voor antibiotica. Hierdoor worden er meer
enzymen geproduceerd die crosslinks vormen, maar deze crosslinks worden niet afgebroken door de
antibiotica.
1. LA-MRSA: livestock-associated MRSA, krijg je via veedieren.
2. CA-MRSA: community-associated MRSA, krijg je via de bevolking.
3. HA-MRSA: Healthcare-associated MRSA, krijg je via het ziekenhuis.
Wanneer er sprake is van een MRSA infectie wordt er meestal behandeld met antibiotica, tenzij de
infectie oppervlakkig en gelokaliseerd is zonder koorts. Welk antibioticum wordt ingezet is
afhankelijk van de gevoeligheid van de MRSA:
Muripirocine is neuszalf. Behandeling van oppervlakkige bacteriën. Het remt de bacteriële
eiwitsynthese.
Vancomycine is speciaal voor MRSA stammen. Het remt de bacteriële celwandsynthese, het tast de
permeabiliteit aan van de bacteriële celwand en het blokkeert de RNA-synthese.
Bloedagar is een niet-selectief, rijk medium, waar de meeste micro-organismen goed op kunnen
groeien.
MRSA chroomagar is een selectief medium met een chromogene mix: MRSA kolonies krijgen hierop
een bepaalde kleur (groen of roze). Kolonies die niet aankleuren of een andere kleur krijgen zijn niet
verdacht voor MRSA.
, Principe katalase: Deze test toont de aanwezigheid van katalase aan. Het wordt gebruikt om
bacteriën die het enzym katalase produceren (zoals stafylokokken) te onderscheiden van niet
katalase producerende bacteriën (zoals streptokokken). Het enzym zorgt voor de afbraak van
waterstofperoxide in zuurstof en water. De aanwezigheid van het enzym is duidelijke wanneer er
zuurstofbellen opkomen als een klein druppeltje van het materiaal in waterstofperoxide wordt
gebracht. Belangrijk is dat de cultuur niet ouder mag zijn dan 24 uur.
Principe coagulase: Deze test wordt gebruikt om staphylococcus aureus (positief) te onderscheiden
die het enzym coagulase produceren (negatief). Het principe van deze test is dat coagulase een
enzymachtig eiwit is en ervoor zorgt dat plasma stolt door fibrinogeen om om te zetten in fibrine.
Staphylococcus aureus produceert twee vormen van coagulase: gebonden (hierbij gaan cellen
klonteren) en vrij.
Bij een gevoeligheidsbepaling m.b.v. de disk-agardiffusie methode volgens Kirby en Bauer wordt
gebruik gemaakt van discen met een bepaalde hoeveelheid antibiotica. Een
gevoeligheidsvoedingsbodem (MH agar) wordt gelijkmatig beënt met een bepaald inoculum van de
te onderzoeken bacteriestam. De discen worden op de agar gelegd met de speciale dispenser en
overnacht geïncubeerd (en niet langer!). Vanuit de disc begint het antibioticum direct in de
voedingsbodem te diffunderen. In het medium ontwikkelt zich een gradiënt van antimicrobiële
concentraties, deze is het hoogst vlakbij het tabletje en neemt af naarmate de afstand groter wordt,
tot deze tenslotte 0 μg/ml is. De volgende dag wordt de diameter in millimeters van de
remmingszone gemeten (tot op 1 mm nauwkeurig)
Bij een E-test wordt in plaats van een disc, een stripje met verschillende concentraties antibiotica op
de beënte plaat gelegd. Vanuit de strip diffundeert een continue concentratiegradiënt van het
antibioticum in de agar. Deze strip bevat langs de ene kant een continue concentratiegradiënt van
een gestabiliseerd en gevriesdroogd antibioticum, en langs de andere kant een concentratieschaal
om de MIC-waarde te kunnen aflezen. Na incubatie kan de MIC afgelezen worden daar waar de
remmingszone de strip raakt.
Standaardisatie van inoculum dichtheid, dikte van de agarlaag en incubatietijd is essentieel bij een
gevoeligheidsbepaling. Voor een gevoeligheidsbepaling wordt een standaard van 0,5 McFarland (dit
komt overeen met 1,5 x108 bacteriën/mL) gebruikt.
Waarom wordt de gevoeligheid voor oxacilline getest en niet voor methicilline?
MRSA is resistent voor methicilline en antibiotica die hier op lijken. Wanneer de bacteriën die getest
worden resistent zijn voor oxacilline, zijn ze dit dus ook voor methicilline.
Naast de gevoeligheidsbepaling wordt ook de MRSA sneltest uitgevoerd. Deze test de aanwezigheid
van PBP2a: latex beads zijn gecoat met antilichamen tegen PBP2a. Als de S. aureus stam een
gemodificeerd PBP heeft (dus PBP2a ook wel PBP2’ genoemd), dan kunnen de antilichamen daaraan
binden en krijg je agglutinatie.
Deze multiplex PCR resulteert dus in 2 PCR producten, elk met een eigen fluorophore: een mecA
fragment, gelabeld met FAM en een nuc fragment, gelabeld met HEX. We zijn alleen geïnteresseerd
in de aanwezigheid van het mecA en nuc, niet in de expressie. Dit is dus een kwalitatieve PCR.
Bij QPCR wordt tijdens de reactie de vorming van de nieuwe fragmenten gevolgd, door ze te labellen met een
synthetische DNA-probe met een fluorescente kleurstof. Het aantal cycli waarbij het DNA-signaal boven de
detectiegrens (treshold) uitkomt (Ct-waarde) is een maat voor de oorspronkelijke DNA-concentratie in het
monster.
