Hoorcollege 1: Flowcytometrie
Immunologisch onderzoek :
Identificeren van cellen
Karakteriseren van cellen
Isoleren van cellen : functionele testen uitvoeren
Het zichtbaar maken van antigenen in/op cellen met behulp van antilichamen = CIE
Hoe onderscheiden we de cellen ? Alle 10 basisspellers hebben een eigen CD marker ( epitopen dat
cell types identificeren, ook in de fases van differentiatie )
= Immunochemie / immunofluorescentie
Antilichamen : geproduceerd door B cellen in reactie op specifiek antigenen, reageren specifiek met
één epitoop ( sleutelslot)
- Gebruik van antilichamen om verschillende cellen te herkennen.
- Antilichaam met fluorescent label ! (aanstralen bij bepaalde golflengte en uitstralen bij
andere golflengte)
Als antilichaam bindt aan de marker ontstaat er een kleur. Niet dezelfde fluorescente kleur = ander
antilichaam.
Fluorescentie microscoop :
Voordeel
- Bepalen van locatie van cellen/antigenen
Nadelen
- Kost veel tijd
- Moeilijk te kwantificeren (subjectief)
Flowcytometrie :
- Cellen in suspensie worden gelabeled met antilichamen met een
fluorescent label.
- Cellen worden geanalyseerd m.b.v detector = snelle, individuele
analyse van vele cellen = verschillende detectoren
De eerste plot die je maakt : FSC/SSC
Forwards scatter = celgrootte
Side scatter = granulariteit
, Altijd ongekleurd sample/ isotype meenemen om te bepalen waar negatieve liggen!
Er moet meer FITC worden afgetrokken van PE signaal: want er zou geen PE signaal moeten zijn :
geen antilichamen die kunnen binden… (Dus -FITC moet omhoog)
FACS = fluorescence-activated cell sorting : op basis van een apparaat fluorescentie en alle soorten in
buisjes sorteren.
Hoorcollege 2 : ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay
Toepassingen :
Humane geneeskunde en diergeneeskunde
- Diagnostiek
- Therapie
- Research
Agricultuur
- Plantenhormonen
- Micro-organismen, virussen
Voedselveiligheid
- Micro-organismen, virussen, toxinen
Milieu
- Pesticiden en hun metabolieten (vb atrazine)
- Milieuverontreinigende stoffen (vb dioxines, PBB’s)
Ook hormonen kunnen gemeten worden met ELISA.
ELISA bindt aan alles wat lichaamsvreemd is.
Voordelen ELISA :
- Gemakkelijke toepasbaarheid/ eenvoudige techniek
- Veelzijdig: heel veel verschillende soorten molekulen kunnen gemeten worden (virusdeeltjes,
eiwitten, hormonen, etc.)
- Kwantitatief: hoeveelheden kunnen bepaald worden
- Gevoelig, sensitief: kleine hoeveelheden al detecteerbaar
- Specifiek, reproduceerbaar: kleine foutmarge
ELISA = speciaal soort plastic, alles ( antigen) blijft eraan plakken. (coating)
Alles wordt in overmaat toegevoegd.
Blocking buffer voorkomen van aspecifieke bindingen = lege plekjes opvullen
Algemene stappen in een ELISA :
Immunologisch onderzoek :
Identificeren van cellen
Karakteriseren van cellen
Isoleren van cellen : functionele testen uitvoeren
Het zichtbaar maken van antigenen in/op cellen met behulp van antilichamen = CIE
Hoe onderscheiden we de cellen ? Alle 10 basisspellers hebben een eigen CD marker ( epitopen dat
cell types identificeren, ook in de fases van differentiatie )
= Immunochemie / immunofluorescentie
Antilichamen : geproduceerd door B cellen in reactie op specifiek antigenen, reageren specifiek met
één epitoop ( sleutelslot)
- Gebruik van antilichamen om verschillende cellen te herkennen.
- Antilichaam met fluorescent label ! (aanstralen bij bepaalde golflengte en uitstralen bij
andere golflengte)
Als antilichaam bindt aan de marker ontstaat er een kleur. Niet dezelfde fluorescente kleur = ander
antilichaam.
Fluorescentie microscoop :
Voordeel
- Bepalen van locatie van cellen/antigenen
Nadelen
- Kost veel tijd
- Moeilijk te kwantificeren (subjectief)
Flowcytometrie :
- Cellen in suspensie worden gelabeled met antilichamen met een
fluorescent label.
- Cellen worden geanalyseerd m.b.v detector = snelle, individuele
analyse van vele cellen = verschillende detectoren
De eerste plot die je maakt : FSC/SSC
Forwards scatter = celgrootte
Side scatter = granulariteit
, Altijd ongekleurd sample/ isotype meenemen om te bepalen waar negatieve liggen!
Er moet meer FITC worden afgetrokken van PE signaal: want er zou geen PE signaal moeten zijn :
geen antilichamen die kunnen binden… (Dus -FITC moet omhoog)
FACS = fluorescence-activated cell sorting : op basis van een apparaat fluorescentie en alle soorten in
buisjes sorteren.
Hoorcollege 2 : ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay
Toepassingen :
Humane geneeskunde en diergeneeskunde
- Diagnostiek
- Therapie
- Research
Agricultuur
- Plantenhormonen
- Micro-organismen, virussen
Voedselveiligheid
- Micro-organismen, virussen, toxinen
Milieu
- Pesticiden en hun metabolieten (vb atrazine)
- Milieuverontreinigende stoffen (vb dioxines, PBB’s)
Ook hormonen kunnen gemeten worden met ELISA.
ELISA bindt aan alles wat lichaamsvreemd is.
Voordelen ELISA :
- Gemakkelijke toepasbaarheid/ eenvoudige techniek
- Veelzijdig: heel veel verschillende soorten molekulen kunnen gemeten worden (virusdeeltjes,
eiwitten, hormonen, etc.)
- Kwantitatief: hoeveelheden kunnen bepaald worden
- Gevoelig, sensitief: kleine hoeveelheden al detecteerbaar
- Specifiek, reproduceerbaar: kleine foutmarge
ELISA = speciaal soort plastic, alles ( antigen) blijft eraan plakken. (coating)
Alles wordt in overmaat toegevoegd.
Blocking buffer voorkomen van aspecifieke bindingen = lege plekjes opvullen
Algemene stappen in een ELISA :
